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Viele der Enzyme, die an der Peptidbiogenese beteiligt sind, wurden identifiziert

Die häufigsten Schritte der Vorläuferverarbeitung und die beteiligten Enzyme sind in Abbildung 18-5 dargestellt. Die beteiligten Endoproteasen sind die Prohormonkonvertasen 1 und 2 (PC1 und PC2), die Exopeptidase ist die Carboxypeptidase E (CPE, auch CPH und Enkephalin-Konvertase genannt) und das α-amidierende Enzym ist die Peptidylglycin-α-amidierende Monooxygenase (PAM). Viele Schritte in ihrer Biosynthese sind nicht einzigartig für Neuropeptide, wie die Spaltung von Signalpeptiden, die Bildung von Disulfidbindungen, die Addition und anschließende Modifikation von N- und O-gebundenen Oligosacchariden, Phosphorylierung und Sulfatierung. Wie in Abbildung 18-3 dargestellt, finden viele der posttranslationalen Schritte statt, wenn die reifenden Neuropeptide das Axon hinunter zur Synapse in den LDCVs wandern. Die späteren Schritte der Neuropeptidbiosynthese (Abb. 18-5) sind nur in Neuronen und endokrinen Zellen zu finden.

Zu den Schlüsselenzymen der Neuropeptidbiosynthese gehören Endoproteasen, Exoproteasen und Enzyme, die die Enden der Peptide modifizieren. Die Entdeckung und Charakterisierung von Kex2p, der Endoprotease, die den Pro-α-Paarungsfaktor der Hefe spaltet, um vier Kopien des Pheromons α-Paarungsfaktor zu erzeugen (Abb. 18-2), war der Schlüssel zur Entdeckung der Prohormonkonvertasen der Säugetiere, einschließlich Furin, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC und PACE4 . Die Prohormonkonvertasen weisen eine Homologie mit bakteriellen Subtilisinen auf und haben eine katalytische Asp-His-Ser-Triade, die aus drei Schlüsselaminosäuren besteht, die an der Katalyse beteiligt sind (in Abb. 18-5 mit D, H und S bezeichnet). Die Proregion jedes Proteins (Abb. 18-5) muss während der Biosynthese vorhanden sein, damit sich die Protease korrekt falten kann, muss aber entfernt werden, um eine aktivierte Protease zu erhalten. Bei PC1 und Furin erfolgt die Entfernung der Proregion innerhalb weniger Minuten nach der Biosynthese, während sich das Enzym im endoplasmatischen Retikulum befindet, und ist höchstwahrscheinlich ein autokatalytischer Vorgang. Bei den anderen Prohormonkonvertasen erfolgt die Entfernung der Proregion wesentlich langsamer. Die Expression von aktivem PC2 erfordert die Koexpression des Peptids 7B2 (Abb. 18-5), das offenbar eine Chaperonfunktion ausübt und möglicherweise auch die Expression der endoproteolytischen Aktivität von PC2 verhindert, bis PC2 in den sekretorischen Granula abgelagert wurde. Für die anderen Prohormonkonvertasen wurde kein entsprechendes Chaperon/Inhibitor-Peptid identifiziert.

Die Säugetier-Endoproteasen, die am deutlichsten an der Neuropeptidverarbeitung beteiligt sind, sind PC1 und PC2, Ca2+-abhängige Proteasen, die in sekretorischen Granula zu finden sind und deren Expression auf Neuronen und endokrine Zellen beschränkt ist (Abb. 18-5). Mehrere andere Mitglieder dieser Endoprotease-Familie sind breiter exprimiert, während wieder andere an begrenzten Orten exprimiert werden, die sich von Neuronen und endokrinen Zellen unterscheiden. Furin beispielsweise kommt in praktisch allen Zellen vor und ist vor allem im trans-Golgi-Netzwerk lokalisiert; Furin katalysiert Spaltungen, die für die Peptidfunktion wichtig sind, wie die anfängliche Spaltung der ELH-, Nervenwachstumsfaktor- und Parathormonvorläufer sowie die Spaltung innerhalb des Insulinrezeptorvorläufers, um die aktive αβ-Dimerform des Rezeptors zu erzeugen. Furin kann auch bei der Aktivierung einiger anderer verarbeitender Enzyme, wie PC2 und CPE, eine wichtige Rolle spielen.

PC1 und PC2 spalten an ausgewählten Paaren basischer Aminosäuren in Peptidvorläufern: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys und Arg-Lys. PC1 kann auch Spaltungen an den ausgewählten einzelnen Arg-Stellen katalysieren, die in einigen Vorläufern wie Prosomatostatin und Procholecystokinin vorhanden sind. Die Spaltungen in LDCVs durch PCs sind streng kontrolliert und laufen oft in einer sehr geordneten Weise ab (Abb. 18-6). Die ersten Abspaltungen von POMC erfolgen in weniger als 1 Stunde (Abb. 18-6, Schritte 1 und 2), während andere Abspaltungen erst nach mehreren Stunden erfolgen (Abb. 18-6, Schritte 6 und 7). Die endoproteolytische Spaltung von Propeptiden ist häufig die geschwindigkeitsbeschränkende Reaktion bei der biosynthetischen Verarbeitung von Peptiden.

Das Muster der Spaltungen, die von PC1, PC2 und Furin katalysiert werden, wenn sie in Neuronen und endokrinen Zellen exprimiert werden, ist viel selektiver als das Muster der Spaltungen, das in Reagenzglasversuchen mit gereinigten Enzymen beobachtet wird. Obwohl Prohormonkonvertasen in der Regel am COOH-Terminus eines Paares von basischen Resten in Modellpeptidsubstraten spalten, können die Spaltungen in Zellen in der Mitte der Paare von basischen Resten liegen, wie im Fall der POMC-Spaltung (Abb. 18-6), wo die basischen Reste getrennt werden und in den beiden resultierenden reifen Peptiden verbleiben. Es ist wahrscheinlich, dass die Ca2+-Konzentration und der interne pH-Wert der LDCVs zwei Variablen sind, die von Neuronen und endokrinen Zellen verwendet werden, um die endoproteolytische Aktivität in den LDCVs zu regulieren.

Es kann gezeigt werden, dass weitere Endoproteasen eine Rolle bei der Neuropeptidbiosynthese spielen. Führende Kandidaten sind das Säugetierhomolog der Hefe-Aspartylprotease-3 (YAP-3) und die N-Arginin-dibasische (NRD) Konvertase. Eine weitere Besonderheit der Peptidbiosynthese findet sich im Herzen, wo der proatriale natriuretische Faktor (proANF) in den LDCVs gespeichert wird, während der reife ANF aus den Vorhofzellen in den Blutkreislauf abgegeben wird. An der Verarbeitung von proANF, die eine Spaltung nach einem einzigen Arg-Rest in proANF beinhaltet, können PC1 oder PC2 nicht beteiligt sein, da diese PCs im Herzen nur in vernachlässigbaren Mengen vorhanden sind.

CPE ist ein lösliches Protein, das in praktisch allen LDCVs in Neuronen und endokrinen Zellen zu finden ist (Abb. 18-5) . Es entfernt basische Reste, Lys oder Arg, von den COOH-Termini von Peptidintermediaten, die von den Prohormonkonvertasen produziert werden. Ursprünglich wurde es durch seine Gewebeverteilung und Substratspezifität sowie durch seine spezifische Hemmung durch Guanidinoethylmercaptosuccinic acid (GEMSA) identifiziert. CPE ist ein Co2+- und Zn2+-aktiviertes Enzym mit einer kurzen Proregion, die normalerweise während der Reifung des Enzyms entfernt wird; im Gegensatz zu den Prohormonkonvertasen ist CPE mit angehängter Proregion aktiv. Die Funktion der Carboxypeptidase bei der Peptidverarbeitung ist normalerweise nicht geschwindigkeitsbeschränkend, da Peptidzwischenprodukte mit COOH-terminalen basischen Resten nur in extrem niedrigen Konzentrationen in Gewebe- oder LDCV-Extrakten nachgewiesen werden. Kürzlich wurden weitere Carboxypeptidasen identifiziert, insbesondere CPD, eine integrale Membranform des Enzyms mit drei Carboxypeptidase-Domänen. Die relative Bedeutung von CPE und diesen zusätzlichen Carboxypeptidasen für die Neuropeptidverarbeitung in vivo ist unklar. In Anbetracht der Tatsache, dass die Spaltung an einem Paar basischer Reste in der Mitte des Paares liegen kann, gibt es gute Gründe für die Annahme, dass eine Aminopeptidase in LDCVs zu finden ist.

PAM ist ein bifunktionelles Enzym, das in fast allen LDCVs zu finden ist (Abb. 18-5) . PAM wirkt auf Peptidsubstrate nach endoproteolytischer Spaltung und Exopeptidase-Aktion, wenn ein COOH-terminaler Gly-Rest freigelegt ist, und wandelt das Peptidyl-Gly in das entsprechende Peptid-NH2 um. Etwa die Hälfte der bekannten bioaktiven Peptide sind α-amidiert, und die α-Amidierung ist im Allgemeinen entscheidend für die biologische Wirksamkeit. Die Peptidyl-Gly- und Peptid-COOH-Formen sind bei physiologischen Konzentrationen normalerweise inaktiv. Der erste Schritt der α-Amidierungsreaktion wird von der Peptidylglycin-α-hydroxylierenden Monooxygenase (PHM) durchgeführt, die der NH2-terminale Teil des bifunktionellen PAM-Proteins ist. PHM bindet zwei Cu2+-Atome, die an der Katalyse beteiligt sind, indem sie Reduktions- und Oxidationszyklen durchlaufen. PHM verwendet Ascorbinsäure als Reduktionsmittel, wobei ein Sauerstoffatom aus O2 während des Hydroxylierungsschritts in das Peptid eingebaut wird. Somit ist PHM enzymatisch der Dopamin-β-Mono-Oxygenase (DBM) sehr ähnlich, die Dopamin in Noradrenalin umwandelt (siehe Kap. 12). Der zweite Schritt der α-Amidierungsreaktion wird von einer zweiten enzymatischen Domäne der PAM durchgeführt, der Peptidyl-α-hydroxyglycin-α-amidierenden Lyase (PAL). Die PAL-Domäne stellt ein neues, von zweiwertigen Metallionen abhängiges Enzym dar. Neuronen exprimieren in erster Linie eine integrale Membranform des bifunktionalen PAM-Proteins (Abb. 18-5), während ein zusätzliches mRNA-Splicing-Ereignis einige endokrine Zellen in die Lage versetzt, lösliche Versionen des Proteins zu exprimieren, denen die Transmembrandomäne fehlt. Bei den integralen Membranformen von PAM erstreckt sich die kurze COOH-terminale Domäne in das Zytoplasma und ist an der Weiterleitung von PAM zwischen den LDCVs und der Zelloberfläche beteiligt. Die Versorgung mit reduziertem Ascorbat in den LDCVs wird durch Cytochrom B561 aufrechterhalten, ein Protein mit fünf Transmembrandomänen, das Elektronen vom zytosolischen Ascorbat zum Ascorbat im Lumen der LDCVs transportiert. Cytochrom B561 findet sich auch in Katecholamin-haltigen Vesikeln, wo es eine ähnliche Funktion für DBM erfüllt (siehe Kap. 12). Nerven- und endokrine Gewebe halten Konzentrationen von reduziertem Ascorbat aufrecht, die etwa 100-fach über der Blutkonzentration von Ascorbat liegen, während die meisten anderen Gewebe kein Ascorbat konzentrieren.

Einige Peptide haben NH2-terminale Pyroglutaminsäurereste, auch als zyklische Glutaminsäure (<Glu) bezeichnet, die für die Bioaktivität unerlässlich sind, z. B. Thyrotropin-Releasing-Hormon (TRH) und Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH). Das für diesen Schritt verantwortliche Enzym ist die Glutaminylcyclase, die das ursprüngliche NH2-terminale Gln in <Glu umwandelt. Die Regulierung und Funktion der Glutaminylcyclase ist noch nicht umfassend untersucht worden. Eine weitere wichtige, aber seltene Modifikation von Peptiden ist die α-N-Acetylierung (Abb. 18-6 und 18-7). Während der Verarbeitung von POMC erhöht die α-N-Acetylierung die hautabdunkelnde Wirkung von ACTH(1-13)NH2 erheblich, während sie sowohl die adrenale steroidogene Wirkung von ACTH als auch die Opiatwirkung von β-Endorphin aufhebt. Das/die für diese Modifikation verantwortliche(n) Enzym(e) wurde(n) noch nicht gereinigt oder geklont.

Abbildung 18-6 zeigt als Beispiel das Muster der Verarbeitungsschritte im POMC-System . Die ersten endoproteolytischen Schritte (Abb. 18-6, Schritte 1-4) werden durch PC1 vermittelt und kommen in allen POMC-produzierenden Neuronen und endokrinen Zellen vor, normalerweise in der dargestellten numerischen Reihenfolge. Es ist klar, dass die Schritte 1 und 2 im trans-Golgi-Netzwerk eingeleitet werden und sich in den LDCVs fortsetzen, während Schritt 4 nur in den LDCVs stattfindet. Die Schritte 5-7 treten nur in den LDCVs auf und scheinen PC2 zu erfordern. Im erwachsenen Hypophysenvorderlappen enthalten die Kortikotropen PC1, aber nicht PC2, und führen nur die Spaltungen 1-4 durch. Während der frühen postnatalen Entwicklung exprimieren die Kortikotropen jedoch auch PC2, und die Spaltungen 5-7 werden vorübergehend in den Kortikotropen beobachtet. Bei der Ratte nehmen die Expression von PC2 und die Spaltung von ACTH (Spaltung 5) einige Wochen nach der Geburt gleichzeitig ab, etwa zu dem Zeitpunkt, an dem das erwachsene Muster der ACTH-Kontrolle über die adrenale Steroidogenese auftritt.

Melanotrope und ZNS-Neuronen, die POMC bilden, exprimieren sowohl PC1 als auch PC2, und daher sind die kleineren Peptidprodukte in diesen Zellen zu sehen. PAM wird in allen POMC-produzierenden Zellen exprimiert, so dass die α-Amidierung von Joining-Peptid (JP), einem kleinen Peptid ohne klare biologische Funktion, in allen POMC-Zellen rasch erfolgt (Abb. 18-6). In den Melanotropen der Zwischenhypophyse und den POMC-Neuronen des Nucleus solitaire erfolgt die α-N-Acetylierung von ACTH(1-13)NH2 und β-Endorphin. In Melanotropen kann die α-N-Acetylierung von ACTH vor der Spaltung erfolgen 5. Wie in Abbildung 18-4 dargestellt, bestimmen die jeweiligen Spaltungen und die an den NH2- und COOH-Termini der Peptidprodukte vorgenommenen Modifikationen die Mischung der freigesetzten bioaktiven Peptide.