BIOPROCESS ENGINEERING
Bewertung der mikrobiellen Diversität von denitrifizierenden Bakterien in Batch-Reaktoren
S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*
ABSTRACT
Mikrobielle Gemeinschaften in einer industriellen Belebtschlammanlage können zum Denitrifikationsprozess beitragen, aber es gibt nur wenige Informationen über die in denitrifizierenden Reaktoren vorhandenen Mikroorganismen. Die Entfernung von anorganischen Stickstoffverbindungen kann durch die Zugabe von Kohlenstoffquellen zum biologischen Prozess der Denitrifikation erreicht werden. Ethanol ist in tropischen Ländern wie Brasilien, wo Zuckerrohr in großem Maßstab produziert wird, eine wirtschaftlich sinnvolle Alternative als Kohlenstoffquelle. Dieser Artikel berichtet über die erfolgreiche Anwendung von Belebtschlamm mit Nitrat und Ethanol in einem anaeroben Batch-Reaktor. Der Betrieb dauerte 61,5 Stunden mit einem Gesamtverbrauch von Nitrat in 42,5 Stunden, Nitritbildung (2,0 mg/L) und Ethanolverbrauch (830,0 mg/L) in 23,5 Stunden. Die Anzahl der denitrifizierenden Zellen nach der wahrscheinlichsten Zahl war zu Beginn des Betriebs niedriger als am Ende, was die Fähigkeit des Inokulums aus Belebtschlamm für den Denitrifikationsprozess bestätigt. Die Proben wurden anhand der Zellzahlen als Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. und nicht kultivierte Bakterien identifiziert. Daher können diese Arten an der Nitratreduktion und dem Ethanolverbrauch im Batch-Reaktor beteiligt sein.
Schlüsselwörter: Belebtschlammsystem; Acidovorax; Acinetobacter; Nitrat; Ethanol.
EINFÜHRUNG
Mikroorganismen, die zur Denitrifikation fähig sind, sind in der Natur weit verbreitet: im Boden, im Sediment, im Süßwasser, im Meer und in Kläranlagen (Park & Yoo, 2009).
Viele Inokula aus häuslichen und industriellen Kläranlagen können denitrifizierende Bakterien enthalten, vor allem in Belebtschlammsystemen (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), wo die biologische Stickstoffentfernung stattfindet, um die Denitrifikation zu fördern, d.h. unter heterotrophen anoxischen Bedingungen wirken die organischen Kohlenstoffquellen als Elektronendonatoren und reduzieren Nitrat zu Stickstoffgas (Canto et al., 2008). Das Vorhandensein von organischem Kohlenstoff und Energiequellen ist für die heterotrophe Denitrifikation notwendig (Nava et al., 2010).
Die meisten denitrifizierenden Bakterien gehören zum Phylum der Proteobakterien, darunter Acidovorax, Comamonas und Acinetobacter, um nur einige zu nennen. Solche Bakterien können in der Abfallbehandlung, insbesondere in Belebtschlammsystemen, vorhanden sein, die in der Lage sind, molekularen Stickstoff aus Nitrat und einer exogenen Kohlenstoffquelle, wie Ethanol, zu bilden. Die vollständige Denitrifikation, d. h. die Umwandlung von Nitrat in Stickstoffgas, erfolgt durch Bakterienarten, die normalerweise Luftsauerstoff als Energiequelle nutzen (aerobe Atmung), die aber auch in der Lage sind, Nitrat und Nitrit anstelle von Sauerstoff zu nutzen (anoxischer Zustand). So können diese Bakterien in Abwesenheit von Nitrat aerob oder in Anwesenheit von Nitrat unter anoxischen Bedingungen wachsen. Die Umwandlung von Nitrat in molekularen Stickstoff wird auch als anoxische Atmung bezeichnet (Park & Yoo, 2009).
Es wurde eine Vielzahl von organischen Verbindungen verwendet, wie Methanol, Ethanol, Glucose, Acetat, Aspartat oder Ameisensäure und aromatische Verbindungen (Queiroz et al., 2011). Die meisten veröffentlichten Forschungsarbeiten zur Denitrifikation von Trinkwasser betreffen jedoch die Verwendung von Methanol, Ethanol und Essigsäure (Park & Yoo, 2009). Ethanol (Daniel et al., 2009), Glukose und Acetat sind einige der externen Elektronendonoren, die erfolgreich für die Denitrifikation eingesetzt werden. Insbesondere in Brasilien stellt Ethanol eine praktikable Alternative dar (Gavazza dos Santos et al., 2004). Ethanol wird in Brasilien seit 1975 im Rahmen des Nationalen Programms für Alkohol (19751985) in großem Maßstab hergestellt. Brasilien produziert fast 2,6 x 108 Tonnen Zuckerrohr, das in 324 Zuckerfabriken zu Zucker und Ethanol verarbeitet wird (Borrero et al., 2003). Zuckerrohr ist reichlich vorhanden und kostet in der Regel weniger als andere geeignete Kohlenstoffquellen. Dennoch erhöht die Notwendigkeit zusätzlicher Elektronendonorquellen für den exogenen Prozess die Betriebskosten, was möglicherweise einen Nachteil für den Einsatz innovativer Technologien auf Basis anaerober Prozesse darstellt (Gavazza dos Santos et al, 2004).
Die stöchiometrischen Beziehungen, die die bakterielle Energiereaktion beschreiben (Park & Yoo, 2009), werden wie folgt geschrieben, wenn Ethanol als Kohlenstoffquelle verwendet wird:
0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 + 0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O
Auch wenn diese Gleichung die stöchiometrische Menge an Ethanol angibt, die für die Nitratdissimilation erforderlich ist, wird zusätzliches Ethanol für die Desoxygenierung und die Zellsynthese benötigt. In der Praxis werden 25 bis 30 % des benötigten Ethanols für die bakterielle Zellsynthese verwendet. Wenn gelöster Sauerstoff vorhanden ist, ist der Ethanolbedarf entsprechend höher. Daher liegt ein üblicher Arbeitswert für das Gewichtsverhältnis von Substrat zu Nitrat (C:N03) bei nahezu 3 (Park & Yoo, 2009).
Es gibt nur wenige Referenzen über Batch-Reaktoren und den Denitrifikationsprozess. Diese Konfigurationen können genutzt werden, um den Nährstoffbedarf zu untersuchen (Maintinguer et al., 2008). Der Denitrifikationsprozess mit komplexen Kohlenhydraten wird in Batch-Reaktoren untersucht, da die in diesen Systemen vorhandenen partikulären organischen Stoffe den Betrieb in anderen Konfigurationen, wie z. B. mit Stärke, erschweren können (Iamamoto, 2006). Außerdem bleibt die Biomasse im Batch-Reaktor im Vergleich zu kontinuierlichen Durchflussreaktoren während der gesamten Betriebszeit erhalten. Diese Tatsachen können zum Gesamtnitratverbrauch beitragen, der im Batch-Reaktor nachgewiesen wurde (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).
Die Nitratentfernung mit Belebtschlamm-Inokulum wurde insbesondere in Ländern mit gemäßigtem Klima untersucht. Es gibt nur wenige Berichte über Studien zur Nitratentfernung und Molekularbiologie mit Belebtschlamm-Inokulum aus tropischen Ländern wie Brasilien. In diesem Sinne bestand das erste Ziel unserer Studie darin, den Denitrifikationsprozess mit Belebtschlamm als Inokulum aus tropischen Klimazonen zu bewerten. Das zweite Ziel unserer Studie war die mikrobielle Charakterisierung des Inokulums mit dem Ziel, die potenziellen Organismen zu identifizieren, die speziell am Denitrifikationsprozess beteiligt sind.
Diese Arbeit untersuchte die mikrobielle Vielfalt der Denitrifikation in einem mit Ethanol und Nitrat gefütterten Batch-Reaktor unter Verwendung von Techniken der Molekularbiologie und der traditionellen Methodik der Mikrobiologie.
MATERIAL UND METHODEN
Batch-Reaktor
Das Experiment wurde mit Schlamm aus dem Belebtschlammsystem der Kläranlage von Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brasilien) durchgeführt.
Die Batch-Reaktoren wurden in dreifacher Ausführung in Duran®-Kolben von 2 L vorbereitet, wobei 1 L Reaktionsmedium, 10% (v/v) Inokulum (100 mL/L) war.
Die Reaktoren wurden nach der Verteilung der Lösungen für 20 min einer N2-Atmosphäre (99,99%) ausgesetzt. Danach wurden sie mit Butylkautschukstopfen verschlossen, eingewickelt und bei 25 ºC ± 1 ºC gehalten, wobei 61,5 h lang mit 120 U/min gerührt wurde.
Physikalisch-chemische und chromatographische Analyse
Die gesamten flüchtigen Feststoffe (TVS) und der Nitratverbrauch wurden nach APHA, 2005, spektrophotometrisch bestimmt. Die Nitritanalyse wurde mittels Fließinjektion (FIA APHA, 2005) durchgeführt. Die flüchtigen Fettsäuren und Alkohole wurden gaschromatographisch in einem Shimadzu GC-2010, ausgestattet mit einem Flammenionisationsdetektor, Autosampler für Headspace COMBI-PAL – AOC Modell 5000 und HP-INNOWAX Säule (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm Filmdicke), nach Maintinguer et al. bestimmt, 2008).
Quantifizierung denitrifizierender Bakterien
Die höchstwahrscheinliche Anzahl (MPN) denitrifizierender Bakterien wurde bei fünffacher Verdünnung zu Beginn und am Ende des Betriebs des Batch-Reaktors nach Tiedje (1982), angepasst für flüssige Proben, durchgeführt. Die Zellzahlen nach der MPN-Methode wurden nach 15 Tagen Inkubation gemäß APHA (2005) bestimmt. Die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Nitrat- und Ethanolkonzentrationen, die bei den MPN-Tests verwendet wurden, waren ähnlich wie beim Betrieb des Batch-Reaktors, wie bereits erwähnt.
Molekularbiologie
Die Proben für die Analyse der 16S rRNA wurden aus den höchsten positiven Verdünnungszahlen (MPN) der denitrifizierenden Bakterien am Ende des Tests aus den Batch-Reaktoren gewonnen.
Die gesamte genomische DNA der Proben wurde nach Zelllyse mit Glasperlen (Sigma) und Phenol-Chloroform-Extraktion, wie zuvor von Griffiths et al. (2000) beschrieben, gewonnen.
Die Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit einem bakteriellen Domänen-Primer-Set für das 16S rRNA-Gen durchgeführt, 27 vorwärts (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) und 1100 rückwärts (5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). Die PCR (Thermo Cycler Eppendorf AG – Hamburg 22.331) Amplifikation wurde mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 ºC für 5 min durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen der Denaturierung bei 94 ºC für 45 s, Annealing bei 55 ºC für 45 s, Verlängerung bei 72 ºC für 1,45 min und abschließender Verlängerung bei 72 ºC für 7 min und Abkühlung bei 4 ºC.
Proben der PCR (Polymerase-Kettenreaktion)-Produkte (16S rRNA) wurden in den Plasmidvektor pGEM (Promega Easy Vector System I) nach den Angaben des Herstellers kloniert. Die Klone wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und durch PCR amplifiziert. Die Nukleotidsequenzierung wurde auf einem automatisierten ABI 310 PRISM Sequenzer (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines M13-Vorwärtsprimers (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983) durchgeführt. Die PCR (Thermo-Cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) wurde mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 ºC für 2 min durchgeführt, gefolgt von 25 Zyklen mit Denaturierung bei 94 ºC für 1 min, Annealing bei 55 ºC für 1 min, Verlängerung bei 72 ºC für 1 min; und abschließender Verlängerung bei 72 ºC für 7 min und Kühlung bei 4 ºC.
Die Nukleotidsequenzen wurden verarbeitet und mit dem Seqman-Programm (Lasergene DNAstar-Paket) ausgerichtet, um die Signale des Vektors und Basen geringer Qualität zu entfernen. Die ausgerichteten Sequenzen wurden mit dem BLAST-Suchprogramm auf der NCBI-Website ermittelt und mit den Sequenzen des 16S rRNA-Gens der Organismen in den Datenbanken Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) und Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu) verglichen. Der phylogenetische Baum wurde mit der Neighbor-Joining-Methode (Saitou & Nei, 1987) unter Verwendung des Programms MEGA Version 4.1 (Kumar et al., 2008) erstellt. Die Bootstrap-Resampling-Analyse für 1000 Wiederholungen wurde durchgeführt, um das Vertrauen in die Baumtopologien abzuschätzen. Die bekannten Sequenzen von Aspergillus niger (FJ828924.1) wurden hinzugefügt und als Out-Group verwendet.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Das Nitrat war nach 42,5 Stunden Betrieb vollständig verbraucht (Abbildung 1). Die Nitritbildung war reduziert (2,0 mg/L bei 18,5 h) und erfolgte innerhalb von 23,5 Stunden nach dem Betrieb. 1,06 g Ethanol/L (36 % Verbrauch) wurden nach 13,5 Stunden Betrieb bei einer Anfangskonzentration von 1.650 mg/L beobachtet. Der Ethanolverbrauch am Ende des Versuchs betrug 54 % (0,77 g/L in 61,5 Stunden). Diese Ergebnisse entsprachen fast denen von Gusmão et al. (2006). Die Autoren (a.a.O.) beobachteten einen Nitratverbrauch von 98,9 % in 14 h Betriebszeit mit gereinigten Zellen von körnigem Schlamm aus einer anaeroben Schlammdecke (UASB), die Abwässer aus einem Geflügelschlachthof (DAKAR-Tietê SP Brasilien) behandelt, mit Nitrat (350 N-NO3 mg/L), Ethanol (377 mg/L) und Benzol (10 mg/L) als Kohlenstoffquellen.
Methanol (197,78 mg/L) und n-Butanol (23,50 mg/L) wurden zu Beginn des Versuchs nachgewiesen. Diese Alkohole (Metanol und n-Butanol) waren möglicherweise im Inokulum vorhanden. Die Konzentration der Alkohole schwankte bis zum Ende des Versuchs kaum, was darauf hindeutet, dass sie unter diesen denitrifizierenden Bedingungen nicht verbraucht wurden (Abbildung 2).
Die maximale Essigsäurebildung betrug 16,7 mg/L bei 61,5 h Betriebszeit. Die STV-Werte zu Beginn und am Ende des Betriebs des Batch-Reaktors betrugen 5,14 g/L bzw. 11,40 g/L, was auf eine Zunahme der Biomasse um 122 % hinweist. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Betriebsbedingungen des Batch-Reaktors die Entwicklung und den Fortbestand des Bakterienkonsortiums unter denitrifizierenden Bedingungen begünstigten.
In dieser Studie wurde der Prozess der Denitrifikation beobachtet, wie er auch von anderen Autoren beschrieben wurde, die unterschiedliche Konfigurationen für die Reaktoren verwendeten.
Callado & Foresti (2001) betrieb anaerobe Reaktoren, die mit synthetischem Substrat gefüttert wurden, das häusliche Abwässer simulierte, um den größten Teil der kohlenstoffhaltigen Stoffe zu entfernen und die Nitrifikation des Substrats, die Denitrifikation und die biologische Phosphatentfernung im selben Batch-Zyklus in einem sequentiellen anaeroben/aeroben/anaeroben Batch-Reaktor zu fördern. Das System wurde 41 Tage lang mit 84 Zyklen von 12 Stunden bei einer Temperatur von 28±1 ºC betrieben. Die Autoren (a.a.O.) stellten fest, dass die Denitrifikation in der Reaktionsphase abwechselnd unter aeroben und anoxischen Bedingungen stattfand. Beide Prozesse traten nur auf, wenn Natriumacetat (500 mg/L) zu Beginn der anoxischen Phase hinzugefügt wurde.
Etchebehere et al. (2001) testeten Acetat (40 mmol/L) und Glucose (13 mmol/L) als Kohlenstoffquellen für die Denitrifikation in einem anaeroben Batch-Reaktor mit Kaliumnitrat (20 mmol/L) für drei verschiedene Inokula: Schlamm aus einem anoxischen Reaktor (Labormaßstab) zur Entfernung von Kohlenstoff und Stickstoff aus dem Sickerwasser einer Mülldeponie; Schlamm aus einem methanogenen UASB-Reaktor zur Behandlung von Malz und Schlamm aus einem anoxischen Reaktor, der mit Acetat und Nitrat gefüttert wurde. Wie in der vorliegenden Studie beobachtet, wurde Nitrat in den drei untersuchten Schlammproben vollständig verbraucht. Die Autoren (a.a.O.) kamen zu dem Schluss, dass Acetat eine bessere Kohlenstoffquelle als Glukose ist.
Gavazza dos Santos et al. (2004) untersuchten den Denitrifikationsprozess in Batch-Reaktoren, die mit synthetischem Abwasser gespeist wurden, das nitrifizierte Abwässer aus häuslichen Kläranlagen simulierte, wobei drei Elektronendonorquellen verwendet wurden: Methanol (53,3 mg/L), Ethanol (38,3 mg/L) und Methan (neben dem synthetischen Abwasser). Die Autoren (a.a.O.) stellten fest, dass der wirksamste Elektronendonor Ethanol war, der Nitrit und Nitrat vollständig entfernte, wie in dieser Arbeit beobachtet.
Iamamoto (2006) erzielte eine Stickstoffentfernung von mehr als 84 % in einem sequentiellen Batch-Reaktor, der mit Stärke und Ammonium unter abwechselnd anoxischen und aeroben Bedingungen (2h/2h-Zyklen) und 2 mg O2/L für die folgenden Konzentrationen beschickt wurde: 125 mg N-NH4/L und 0,95 g Stärke/L, 250 mg N-NH4/L und 1,9 g Stärke/L, 500 mg N-NH4/L und 3.8 g Stärke/L, mit Inokulum aus einem Belebtschlammsystem einer Kläranlage (Flores da Cunha Rio Claro SP Brasilien). Ethanol (1.500 mg/L) wurde ebenfalls als Kohlenstoffquelle zusammen mit 500 mg NH4-N/L getestet. Die Autoren (a.a.O.) stellten fest, dass die Nitrit- und Nitratentfernung vollständig (100 %) war, wie in der vorliegenden Studie, was die Durchführbarkeit der Verwendung von Ethanol im Denitrifikationsprozess beweist.
Die Anzahl der denitrifizierenden Zellen nach MPN war zu Beginn des Betriebs des Batch-Reaktors niedriger (1,1 x 1010 MPN/mL) als am Ende des Betriebs (1,2 x 1019 MPN/mL) (Abbildung 3). Diese Ergebnisse sind höher als die in der Literatur berichteten Werte, die im Folgenden beschrieben werden.
Etchebehere et al. (2001) zählten denitrifizierende Zellen nach der wahrscheinlichsten Anzahl (MPN) in einem Basismedium, das mit Hefeextrakt (0,5 g/L), Kaliumacetat (1,84 g/L) und Kaliumnitrat (0,72 g/L) ergänzt wurde, und erhielten 9,6 x 106 MPN/mL mit Schlamm aus dem anoxischen Reaktor eines Sickerwasserbehandlungssystems. Callado und Foresti (2001) verwendeten Natriumacetat als Kohlenstoffquelle in einem sequentiellen anaeroben/aeroben/anaeroben Batch-Reaktor und fanden mehr MPN denitrifizierende Bakterien zu Beginn des Betriebs (2,5 x 106 MPN/mL) als am Ende (3,5 x 105 MPN/mL). Die Autoren (a.a.O.) kamen zu dem Schluss, dass dieser Rückgang den Denitrifikationsprozess nicht beeinträchtigte.
Iamamoto (2006) erhielt die gleiche Größenordnung in der MPN der denitrifizierenden Bakterien am Ende des Betriebs eines sequentiellen Batch-Reaktors mit 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 MPN/mL) und 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), beide mit Zugabe von Stärke (1.900 mg/L) als Kohlenstoffquelle und Inokulum aus Belebtschlamm aus einer Kläranlage (Rio Claro SP – Brasilien).
Die denitrifizierenden Bakterien wurden durch die Ernährungsbedingungen im anoxischen Reaktor begünstigt. Diese Tatsache bestätigte die Fähigkeit des Inokulums aus Belebtschlamm für den Denitrifikationsprozess.
Fünfzig Klone wurden aus der untersuchten Probe für die Klonierung und Sequenzierung der 16S rRNA-Genfragmente des mikrobiellen Konsortiums gewonnen. Klone mit Werten von weniger als 180 Nukleotiden wurden jedoch nicht in die phylogenetische Analyse einbezogen, da sie für einen Vergleich mit der unten beschriebenen Datenbank nicht ausreichten. Die Sequenzen aus der Klonierung und Sequenzierung wurden aus der MPN-Probe mit der höchsten positiven Verdünnung (10-18) gewonnen (Tabelle 1).
Acinetobacter sp. wurde mit Ähnlichkeiten von: 98% (Klone 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 und 2, 4, 18, 20, 23 und 27) und 99% (Klone 6, 15, 16, 37 und 38). Es handelt sich um ein gramnegatives Bakterium, nicht beweglich, oxidase-negativ, nicht fermentativ, paarweise und gehört zum Phylum der Proteobakterien, Familie Moraxellaceae. Es ist ein wichtiger Mikroorganismus im Boden, wo es beispielsweise zur Mineralisierung von aromatischen Verbindungen beitragen kann (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) isolierten Acinetobacter-Stämme in einer Probe aus einem Belebtschlammsystem (Jizhuangzi Tianjin – China). Dieser Stamm war in der Lage, Phenol (1,1 g/L) durch freie und immobilisierte Zellen biologisch abzubauen. Geng et al. (2006) isolierten phenolabbauende Bakterien in einer Probe aus einem Belebtschlammbehandlungssystem (Singapur). Biochemische Tests zeigten, dass diese Mikroorganismen in Gegenwart von Ethanol, Glukose, Saccharose und aromatischen Verbindungen wie Toluol, Phenol und Benzoat wachsen können. Es wurde als neue Spezies, Acinetobacter EDP3, beschrieben. Die Autoren (a.a.O.) kamen zu dem Schluss, dass diese Art zur Entfernung von Phenolverbindungen oder zur In-situ-Biosanierung von Phenol in Böden eingesetzt werden kann. Cai et al. (2009) identifizierten 58 resistente Bakterien aus mit Arsen kontaminierten Böden. Die Stämme Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas und Stenotrophomonas wurden in hohen Konzentrationen (20 mM Ar/L) identifiziert. Die in dieser Arbeit identifizierten Acinetobacter sp. hatten ihr Wachstum aufgrund der auferlegten Betriebsbedingungen und könnten zur Denitrifikation beitragen.
Die Klone 24 und 26 ähnelten Comamonas sp. mit einer Ähnlichkeit von 98 % bzw. 97 %. Comamonas sind gramnegative Bakterien, die zum Phylum der Proteobakterien und zur Familie der Comamonadaceae gehören. Etchebehere et al. (2001) isolierten gramnegative denitrifizierende Bakterien aus einem anoxischen Reaktor, der zur Behandlung von Deponiesickerwasser in Montevideo (Uruguay) verwendet wurde. Die isolierte Art hatte Ähnlichkeit mit Comamonas terrigena. Dieser Mikroorganismus wurde jedoch als neue Art betrachtet und Comamonas nitrativorans genannt. Es wurde als gramnegatives Bakterium beschrieben, das polare Geißeln besitzt, aerob und chemoorganotroph ist. Diese Spezies wuchs in Ethanol, Acetat und Butyrat, Nitrat, Nitrit und kann Nitrat zu N2 reduzieren.
Daher waren die in dieser Studie identifizierten Comamonas-Spezies im Inokulum des Belebtschlamms vorhanden und könnten zur Denitrifikation beitragen, die in den Tests stattfand.
Die Klone 25, 28, 34, 36, 42 und 65 ähnelten Acidovorax sp. mit einer Ähnlichkeit von 99% bzw. 97% (Tabelle 1). Acidovorax sp. gehört zum Phylum der Proteobakterien und ist in Belebtschlammsystemen leicht zu finden. Viele Acidovorax-Arten wirken als Regulator-Mikroorganismen bei mikrobiologischen Behandlungsprozessen in Belebtschlammsystemen. Mehrere Acidovorax-Arten werden beim biologischen Abbau von Kunststoffen und bei der Entfernung anderer organischer Schadstoffe, einschließlich Nitrophenolen, Nitrobenzol und polychlorierten Biphenylen, durch Denitrifikation eingesetzt (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) isolierten denitrifizierende Bakterienarten, die PHBV (Poly-3-hydroxy-butyrat-co-3-hydroxyvalerat) abbauen, aus drei Belebtschlammsystemen, die zur Behandlung kommunaler Abwässer eingesetzt werden (Nagoya, Osaka und Toyohashi – Japan). Die 37 analysierten Klone zeigten Ähnlichkeit mit Organismen, die zur Klasse der Betaproteobakterien gehören. Die meisten Klone wiesen Ähnlichkeit mit der Acidovorax-Art auf, was bestätigt, dass diese Art am PHBV-Abbau unter denitrifizierenden Bedingungen beteiligt ist. Gentile et al. (2007) isolierten ähnliche Arten wie Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium und Achromobacter aus einem denitrifizierenden Reaktor, der mit Ethanol (40,0 g/L) und Milchsäure (40,0 g/L) als Kohlenstoffquellen betrieben wurde; sie testeten Elektronendonatoren separat und verwendeten Nitrat (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L) als Stickstoffquelle. Die Autoren (op. cit.) kamen zu dem Schluss, dass die vollständige Nitratreduktion zu N2 von Acidovorax-Arten durchgeführt wurde, während Achromobacter sp. und Delftia acidovorans für die unvollständige Nitratdenitrifikation zu Nitrit verantwortlich waren. Daher waren Acidovorax-Arten in den in dieser Studie analysierten Proben vorhanden und könnten an der Denitrifikation im Batch-Reaktor beteiligt sein.
Unkultivierte Bakterienstämme aus der Familie der Rhodocyclaceae wurden mit 98%iger Ähnlichkeit identifiziert (Klon 9 – AY945917.1 und Klone 46, 84 AY945905), wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Mitglieder der Rhodocyclaceae-Familie sind gramnegative Bakterien, die zur Klasse der Betaproteobacteria gehören. Sie sind denitrifizierende aerobe Stäbchen mit vielseitigen Stoffwechselkapazitäten. Die meisten Arten leben in aquatischen Lebensräumen und unter oligotrophen Bodenbedingungen. Viele von ihnen kommen in Abwässern vor und spielen eine wichtige Rolle bei der biologischen Dekontaminationsbehandlung solcher Standorte (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006) fütterten einen Denitrifikationsreaktor mit Chinolin (40 mg/L), einem toxischen Amin, das bei der Herstellung von Farbstoffen, Pestiziden und synthetischen Kraftstoffen verwendet wird, Glucose (180 mg/L), Nitrat und Kaliumphosphat (C/N/P von 150:30:1). Das Inokulum stammte aus dem zweiten Absetzbecken der Kläranlage der Industry Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japan). Die Chinolinentfernung betrug 90,2 % nach der stationären Reaktorperiode (6 Wochen). Molekularbiologische Analysen des Inokulums und des Denitrifikationsreaktors ergaben in beiden Tests nicht kultivierte Bakterien, Thauera und Azoarcus. Nach Angaben der Autoren betrug der Prozentsatz der Klone, die zu Azoarcus und Thauera gehörten, 74 % im Denitrifikationsreaktor bzw. 4 % im Inokulum. Die Kenntnis von Mikroorganismen aus Umweltproben ist von Laborbedingungen mit Reinkulturen abhängig (Pace, 1997). Allerdings sind weniger als 1 % der Bakterien aus verschiedenen Ökosystemen bekannt (Amann, 1995), oder etwa 99 % sind noch nicht untersucht und identifiziert worden. Daher erwarteten wir in dieser Arbeit, ähnliche Sequenzen von nicht kultivierten Bakterien zu erhalten.
Der phylogenetische Baum, der mit Konsensus-Bakterien-Domänen-Primern in den molekularbiologischen Analysen des Experiments erhalten wurde, ist in Abbildung 4 dargestellt.
Die Ähnlichkeitskoeffizienten zwischen den verschiedenen Gruppen von Mikroorganismen betrugen 97% bis 99% und wiesen auf das Vorhandensein von phylogenetisch verwandten Arten hin, basierend auf den Sequenzen der 16S rRNA-Gen-Teilauswertung. Die bekannten Sequenzen der Arten stammten aus der NCBI-Datenbank mit Aspergillus niger (FJ828924.1) als Out-Group-Sequenz.
Die in dieser Studie identifizierten Acidovorax-, Comamonas- und Acinetobacter-Arten waren also im Belebtschlammsystem von Volkswagen São Carlos Motors vorhanden und könnten an der Nitratreduktion und dem Ethanolverbrauch beteiligt sein.
ZUSAMMENFASSUNG
Das Potenzial des Inokulums aus einem Belebtschlammsystem und die Verwendung von Ethanol als Kohlenstoffquelle in einem Denitrifikationsprozess wurden in einem Batch-Reaktor nachgewiesen.
Die in dieser Studie erhaltenen MPN-Werte für denitrifizierende Bakterien in Verbindung mit den Ergebnissen für die Entfernung von Nitrat zeigten, dass im Inokulum aus einem Belebtschlammsystem denitrifizierende Bakterien vorhanden waren, die durch die auferlegten Nährstoffbedingungen begünstigt wurden.
Die identifizierten Klone gehörten phylogenetisch zum Stamm der Proteobakterien, zur Klasse der Alphaproteobakterien und Gamaproteobakterien, mit Acidovorax sp, Acinetobacter sp., Comamonas sp. und nicht kultivierten Bakterien. Diese Bakterien könnten an der Nitratreduktion und dem Verbrauch von Ethanol im anoxischen Batch-Reaktor beteiligt sein.
HINWEISE
Die Autoren bedanken sich für die von FAPESP und CNPq erhaltenen Zuschüsse.
APHA, AWWA und WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22. Auflage, American Public Health Association, Washington, DC (2005).
Iamamoto, C. Y., Nitrogen removal in sequencing batch reactor with suspended biomass treating high ammonia concentration wastewater. Doktorarbeit, Universität von São Paulo, Brasilien, School of Engineering, Universität von São Carlos, Brasilien (2006).
Messing, J., New M13 vectors for cloning. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).
Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).