Der Kondensor – verschiedene Typen. Kontrast im Mikroskop
Im vorigen Artikel über das Okular habe ich darauf hingewiesen, dass das Okular normalerweise so angebracht ist, dass seine vordere Brennebene mit der primären Bildebene (PIP) zusammenfällt. Die PIP ist in der Abbildungsgruppe der konjugierten Ebenen mit der Probe konjugiert und eignet sich daher für die Messung von Merkmalen mikroskopischer Proben.
Auf die gleiche Weise ist die vordere Brennebene des Kondensors im Beleuchtungsstrahlengang konjugiert mit der hinteren Brennebene des Objektivs (aber nicht der Probe). Der Kondensor ist also ein zugänglicher Ort, an dem wir den Kontrast des Bildes durch Manipulation der Beleuchtungsstrahlen verändern oder regulieren können. Diese beiden Prinzipien ergeben sich aus der Köhlerschen Beleuchtungsmethode, die in Teil 3 dieser Serie behandelt wurde.
Die Funktion des Kondensors
Der Kondensor erfüllt im Mikroskop zwei Funktionen. Zum einen sorgt er für eine gleichmäßig beleuchtete Fläche im Gesichtsfeld an der Präparateebene und beleuchtet die Objektivöffnung gleichmäßig mit Licht eines ausreichenden, aber kontrollierbaren Winkels. Zweitens bietet er, wie oben erwähnt, ein Mittel zur Regulierung des Kontrasts (Bradbury & Evennett, 1996). Die einfachste Form des Kondensors ist der Hohlspiegel, der jedoch für Objektive mit einer NA von mehr als 0,2 oder so nicht geeignet ist. Wenn Ihr Mikroskop mit einem Spiegel und einer entfernten Lichtquelle ausgestattet ist, muss die flache Seite des Spiegels in Verbindung mit einem Untertischkondensor verwendet werden. Der Grund dafür ist, dass der Kondensor streng genommen eine parallele Beleuchtung erhalten und dieses Licht in der hinteren Brennebene des Kondensors (wo sich das Präparat befindet) fokussieren soll.
Kondensortypen
Der am weitesten verbreitete Kondensortyp ist der Abbe-Kondensor für die Hellfeldmikroskopie (Abbildung 1a, 1b). Er besteht aus zwei oder drei Linsen, wobei die obere, kurzbrennweitige Linse in der Regel aus dem Strahlengang herausgeklappt (1a) oder herausgeschraubt (1b) werden kann, um das Gesichtsfeld mit Objektiven geringerer Leistung zu füllen. Diese einfache Beleuchtungseinrichtung reicht für die meisten Arten der Mikroskopie aus. Sie wurde ursprünglich entwickelt, um schmale Strahlen (oder „Bleistifte“) mit schrägem Licht aus einer exzentrisch angeordneten Blende in der vorderen Brennebene des Kondensors zu erzeugen. Abbildung 1c zeigt eine einfache Abbe-Beleuchtung mit zwei Linsen, die auf einem Untertischgerät montiert ist und zur Erzeugung von Schräglicht gedreht und exzentrisch bewegt werden kann. Abbildung 1d zeigt einen Kondensor mit geringer Leistung, der dazu dient, das große Gesichtsfeld von Objektiven mit sehr geringer Vergrößerung vollständig auszufüllen.
Auch wenn für den Kondensor eine numerische Apertur angegeben wird (häufig 0,9 NA für Trockenkondensoren und maximal 1,4 NA für Ölimmersionstypen), geben diese Zahlen keinen Hinweis auf die NA, für die die Beleuchtungsstrahlen um die sphärische Aberration korrigiert werden. Bei vielen einfachen Kondensoren wird ein fester Lichtkegel für die axiale Beleuchtung nur selten für sphärische Aberration über 0,45 NA korrigiert. Für qualitativ hochwertige Arbeiten und für die Auflösung von Strukturen an der Auflösungsgrenze müssen Kondensoren hinsichtlich der Aberrationen korrigiert werden. Vollständig korrigierte Kondensoren enthalten wie Objektive viele Linsenelemente und können fast in gleichem Maße korrigiert werden. Der achromatisch-aplanatische Kondensor (1e) ist sowohl für sphärische als auch für chromatische Aberration korrigiert und sollte für Arbeiten höchster Qualität und für die Farbmikrofotografie verwendet werden. Aplanatische Kondensoren sind nur für die sphärische Aberration korrigiert.
So genannte „Universal“-Kondensoren (Abbildung 2) sind multifunktional. Sie bestehen aus einer drehbaren Scheibe, die eine Auswahl von Aperturblenden, Filtern, Patch-Stops, Phasenplatten oder Wollaston-Prismen für den differentiellen Interferenzkontrast (DIC) enthält. Diese Anordnung ermöglicht einen bequemen und einfachen Wechsel von einer Kontrastmethode zur anderen. Die Dunkelgrundblende funktioniert im Allgemeinen nur bis NA 0,5 oder darüber hinaus. Für die Verwendung mit Objektiven mit höherer NA muss ein speziell konstruierter Dunkelgrundkondensor (Abbildung 3) verwendet werden. Einzelheiten zu seiner Verwendung und zu anderen Methoden der Kontrastverstärkung siehe Bradbury & Evennett (1996).
Abbildung 2. Universal-Kondensatoren. Das mittlere Bild zeigt den abgenommenen Deckel, auf dem die Drehscheibe zu sehen ist, in der sich die Aperturphasenringe, die DIC-Prismen, die Dark-Ground-Patch-Stops, die Rheinberg-Scheiben und die Hoffman-Modulationsfilter befinden. Die meisten Universalkondensoren besitzen eine Aperturblende für die Hellfeldarbeit, mehrere Ringblenden für den Phasenkontrast und eine Dunkelgrundblende für Dunkelgrund mit geringer Leistung.
Abbildung 3. Dark-Ground-Kondensatoren. 3(a) Trockener Dark-Ground-Kondensator. 3(b) & 3(c) Dunkelgrundkondensatoren mit Öleintauchung. 3(d) Einstellbarer Ölimmersions-Dunkelgrundkondensor; dieser Kondensor kann auf verschiedene Dia-Dicken eingestellt werden, um ein hochwertiges Dunkelgrundbild zu erhalten.
Durchlicht- und Auflichtmikroskopie
Der Aufbau des Durchlichtmikroskops erfordert einen separaten Kondensor, da das Licht zunächst auf der Probe kondensiert wird (wobei das Licht mit der Materie in Wechselwirkung tritt) und dann vom Objektiv weiter entlang der optischen Achse gesammelt wird.
Die Situation im Auflichtmikroskop ist anders. Hier ist der Strahlengang um die Achse des Präparats gefaltet, an dem das Licht von der Oberfläche reflektiert wird. Das Objektiv fungiert als sein eigener Kondensor, und die Ausrichtung des Auflichtmikroskops ist sehr vereinfacht (siehe die Strahlendiagramme in Teil 2 dieser Serie). Allerdings ist die hintere Brennebene des Objektivs (vordere Brennebene bei Verwendung als Kondensor) nur schwer zugänglich, so dass zusätzliche Linsen verwendet werden, um eine Position zu schaffen, in der das Bild von Blenden und Filtern mit der hinteren Brennebene konjugiert ist.
Das Auflichtsystem ist für die Fluoreszenzmikroskopie sehr nützlich, vor allem weil die Beleuchtung des Präparats einfach ist, es effizienter ist (und hellere Bilder bei hohen Vergrößerungen liefert) und die Kombination mit anderen Kontrastverfahren im Durchlicht möglich ist.
Abbildung 4. Illustration eines Epi-Beleuchtungsgeräts für die Auflichtmikroskopie
Dieser Epi-Kondensor hat zwei Arten von Auflichtobjektiven in seinem Objektivrevolver eingebaut. Das verwendete Objektiv ist für die Beleuchtung des dunklen Bodens bestimmt, während die beiden anderen Objektive für die Auflichtmikroskopie im hellen Feld verwendet werden. Die breiten Kragen um die beiden letztgenannten Objektive ermöglichen die Zentrierung des Objektivs auf der optischen Achse. Das „D“ auf dem Gehäuse der Epi-Beleuchtung bezeichnet den austauschbaren Einsatz, mit dem das Gerät für die Dunkelfeld-Beleuchtung verwendet werden kann. Für die Hellfeld-Auflichtmikroskopie kann er gegen einen Planspiegel ausgetauscht werden. Der Durchlichtkondensor wurde von der Unterseite des Tisches entfernt.
Wenn das Objektiv in der Auflichtmikroskopie als eigener Kondensor fungiert, warum werden dann nicht auch Objektive zur Beleuchtung in der Durchlichtmikroskopie verwendet? Abgesehen von der praktischen Schwierigkeit des Zugangs zum Auflagemaß des Objektivs ist es schwierig, Objektive multifunktional einzusetzen, und der Beleuchtungswinkel ist in der Regel nicht steuerbar (durch eine Irisblende im Auflagemaß des Objektivs).
Grundprinzipien der Kontrastverstärkung
Ausreichende Sichtbarkeit oder Kontrast ist erforderlich, damit wir die Details im Bild, das von unseren Mikroskopen aufgelöst wird, wahrnehmen können. Selektivität ist wichtig: Wir brauchen zumindest einige regionale Unterschiede innerhalb des Objekts und zwischen dem Objekt und dem Hintergrund, um Details zu erkennen.
Der Kontrast im Bild wird durch drei Mittel erzeugt, entweder einzeln oder in Kombination. Es handelt sich um:
- die Wechselwirkung zwischen Objekt und Licht,
- die Manipulation der Beleuchtung und
- die Manipulation des Bildaufzeichnungsmediums.
Die Veränderung des Kontrasts in Teil (c) kann durch fotografische Entwicklung und/oder Druck sowie durch elektronischen Kontrast von analogen Video- oder digitalen Bildern erreicht werden. In den Teilen (a) und (b) ist der Kondensor jedoch entscheidend für die Veränderung des Kontrasts und der Sichtbarkeit im Bild. Weitere Einzelheiten zu den theoretischen und praktischen Aspekten der Kontrastverfahren in der Lichtmikroskopie finden sich in Bradbury & Evennett, 1996 und Sanderson, 2002, 2000, 1998 und 1994. Kurz gesagt sind die bekanntesten Formen der Kontrasterzeugung Hellfeld, Schrägbeleuchtung, Dunkelgrund & Rheinberg, Phasenkontrast und DIC. Es ist auch möglich, diese Methoden mit verschiedenen Beleuchtungsformen zu kombinieren (z.B. polarisiertes Licht mit Rheinberg oder Phasenkontrast durch transmittiertes Hellfeld mit einfallender Fluoreszenz). Da die Kontrastverstärkung sehr stark unter der Kontrolle des Mikroskopikers steht, kann die Bedeutung der richtigen Verwendung des Kondensors nicht genug betont werden.
Der Kondensor muss richtig fokussiert werden (siehe Teil 3, Einrichten des Mikroskops für die Köhler-Beleuchtung), um die beste Bildqualität zu erzielen. Dies gilt unabhängig davon, welche Methode der Kontrastverstärkung (Hellfeld, Phase, Dunkelgrund) verwendet wird. Die offensichtlichste Auswirkung eines unfokussierten Kondensors in der Hellfeldmikroskopie ist ein erheblicher Verlust an Auflösungsvermögen, was wiederum zu einem „faulen“ Bild mit Beugungshalos um jeden Punkt im Bild führt. Das gleiche Ergebnis tritt auf, wenn die obere Linse (kurz fokussiert) weggelassen oder ausgeklappt wird, wenn ein Objektiv mit hoher Leistung verwendet wird und die hintere Brennebene des Objektivs nicht vollständig mit Licht gefüllt ist.
Wenn Phasenkontrastmikroskopie mit einem falsch fokussierten Kondensor versucht wird, stimmt der Ring im Kondensor oft nicht mit dem Durchmesser des Phasenrings in der hinteren Brennebene des Objektivs überein, und jegliche Kontrastverstärkung geht verloren. Probleme bei der Fokussierung des Kondensors können auch zu schlechter Dunkelgrundmikroskopie führen, wenn das Bild der Fleckenblende die direkte Beleuchtung durch das Objektiv nicht vollständig verdeckt. Der nächste Teil dieser Serie befasst sich mit dem Objektiv, der Tubuslänge und der Bestimmung von Brennweite, Vergrößerung, Blende und anderen Parametern Ihrer Objektive.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (ed). (1998) Band 3: 15-33, Academic Press. ISBN (4-bändige Reihe) 0-12-164725-0; nur Band 3 = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.