Rozdílné účinky na membránovou propustnost a životaschopnost buněk lidských keratinocytů vystavených megazvukovému poli velmi nízké intenzity

Vliv expozice velmi nízké intenzity US (Ispta mezi 7 a 16 mW/cm2, výrazně pod prahem kavitace, 100 mW/cm2) o frekvenci 1 MHz byl studován na buňkách HaCaT. Experimenty byly prováděny s ekvivalentním lékařským uspořádáním nakresleným na obrázku S1 v ESI při různých parametrech ošetření, jako je Ispta, pracovní cyklus a doba sonikace. Předběžné experimenty ukázaly, že v rozsahu zde uvedených parametrů expozice zůstává teplota konstantní (v rozmezí 1 °C) s vyloučením tepelné disipace energie US. Ošetření navíc nevykazovala žádnou významnou závislost studovaných účinků na pracovním cyklu US vln. Tato pozorování jsou v souladu s nízkou absorpcí US při frekvenci 1 MHz; naopak tepelné účinky a pracovní cyklus by mohly ovlivnit buňky a tkáně vystavené vyšším frekvencím, neboť koeficient útlumu US je úměrný frekvenci23,31.

Výsledky budou zpočátku prezentovány s ohledem na dva relevantní parametry expozice, dobu sonikace a Ispta, samostatně. Budou analyzovány strukturální a fyzikální změny buněčné membrány (propustnost, účinnost vychytávání a maximální velikost internalizovaných molekul) a budou korelovány s odpovídajícím cytotoxickým poškozením a s možnou aktivací zánětlivých vzorců. Poté budou výsledky interpretovány z hlediska sonikační dávky, definované jako součin Ispta a doby expozice, tedy povrchové hustoty akustické energie dopadající na vzorek během sonikace. Ve skutečnosti studované jevy závisí na této veličině, což nám umožnilo určit rozsah parametrů expozice, při nichž dochází k přechodnému SP se zanedbatelným biologickým poškozením.

Analýza vlivu doby expozice US

Změny v propustnosti membrán buněk HaCaT vyvolané US o nízké intenzitě 1 MHz byly hodnoceny z hlediska účinnosti vychytávání zelené fluorescenční sondy kalceinu. Protože intaktní membrány jsou pro kalcein nepropustné, představuje spolehlivý marker pro SP. Procento zeleně pozitivních buněk bylo kvantifikováno analýzou průtokovou cytometrií podle oddílu 2.5.

Pro vyhodnocení citlivosti propustnosti membrán na dobu expozice US byla použita velmi nízká Ispta US. Je pozoruhodné, že již Ispta 7 ± 1 mW/cm2 může vyvolat významné účinky na propustnost membrán při správné době expozice. Reprezentativní výsledky paralelního vyšetření průtokovou cytometrií na buňkách HaCaT a NIH-3T3, které byly sonikovány při Ispta ~7 mW/cm2 po dobu 5′, 15′, 30′ a 45′, jsou uvedeny na obr. 1 (červené trojúhelníky a modré čtverce). Jak se očekávalo, porovnání buněčných linií po nízkých dobách sonikace (pod prahem sonoporace) vede k malé afinitě kalceinu, přičemž rozdíly (nejvyšší u buněk HaCaT) by měly odpovídat jejich příslušným vlastnostem složení a propustnosti membrán. Důležitější je, že obě buněčné linie vykazují výrazný nárůst účinnosti vychytávání od 15′ expozice, což odpovídá sonikační dávce (6,3 ± 0,9) J/cm2 , což naznačuje aktivaci procesu SP. Podle nejlepšího přizpůsobení na obr. 1 ukazují naše experimenty při delších dobách expozice na lineární korelaci mezi účinností vychytávání a dobou expozice se stejnou rychlostí vychytávání vyvolanou US u buněk HaCaT i NIH-3T3 (lineární regresní sklony (%/min) 1,3 ± 0,2, resp. 1,4 ± 0,2 pro HaCaT a NIH-3T3). To by znamenalo, že zvýšení účinnosti vychytávání v důsledku SP je jevem nezávislým na buněčné linii.

Pro další zkoumání procesu SP a charakterizaci internalizace byly ošetřené buňky HaCaT hodnoceny pomocí fluorescenční mikroskopie. V souladu s výsledky průtokové cytometrie nevykazují vzorky sonikované po dobu 5′ žádnou významnou změnu v propustnosti membrány vzhledem ke kontrolnímu (neošetřenému) vzorku, zatímco od 15′ je pozorována rostoucí účinnost vychytávání (jak je uvedeno na obr. 2 a obr. S2 v ESI), i když ne všechny buňky vykazovaly fluorescenci. V souladu s tím se buňky jeví méně husté a přilnavé vzhledem ke kontrolnímu vzorku, což naznačuje uvolnění těsných spojů. Reprezentativní snímky na obr. 2 naznačují heterogenní lokalizaci kalceinu v buňkách a ve skutečnosti konfokální fluorescenční mikroskopie umožnila v buňkách HaCaT jasně odlišit periferní distribuci sondy od vnitřní (viz snímek a 3D rekonstrukce na obr. 3). Další podrobné snímky jsou uvedeny v části 3 ESI. Pozorování odpovídají dvouúrovňovému příjmu fluorosondy: perifernímu, kdy je sonda lokalizována v síti endoplazmatického retikula kolem plazmatické membrány; druhému, který se výrazně projevil po expozici 30′, kdy difuze sondy do cytoplazmy způsobuje intenzivní fluorescenci rovnoměrně rozloženou v celé buňce, včetně nukleoplazmy. Je třeba poznamenat, že Stokesův průměr kalceinu je ~1,36 nm a jeho vnitrojadernému transportu nebrání difuzní bariéry29. Úplnější analýza uvedená v oddílech 3.2 a 3.3 umožňuje dospět k závěru, že dávka expozice US a molekulová hmotnost sondy byly dominantními faktory určujícími vychytávání.

Další test založený na červené PI fluorosondě byl proveden za účelem vyhodnocení obnovení propustnosti nativní membrány sonikovaných buněk (viz také oddíl 2.3). Internalizace PI znamená aktivaci cytotoxických procesů. Kolokalizace zeleného a červeného barviva uvnitř buněk proto ukazuje na selhání procesu obnovy membrány po SP. Na druhou stranu pozorování zelené fluorescence v buňkách při absenci červené fluorescence poukazuje na výskyt membránového SP během ošetření US a jeho úspěšnou obnovu po vypnutí pole. Reprezentativní konfokální fluorescenční snímky jsou uvedeny na obr. 4. Kolokalizace obou barviv chybí v buňkách ošetřených po dobu 15′, zatímco po 30′ expozice není téměř pozorována (obr. S5 v ESI). Důsledně byla zjištěna čistá ztráta životaschopnosti ~5 %, jak bylo ověřeno průtokovou cytometrií. U buněk sonikovaných po dobu 45′, což odpovídá dávce (19 ± 3) J/cm2 , je kolokace zřejmější (viz bílé šipky na obr. 4B) a dochází k výraznější ztrátě životaschopnosti (~10 %, jak bylo ověřeno průtokovou cytometrií). Tato zjištění naznačují, že delší doba expozice, která odpovídá vyšší dávce při fixní Ispta, vyvolává nevratnou změnu ve struktuře membrány a následnou cytotoxickou reakci.

Analýza vlivu intenzity US

Vliv měnící se intenzity aplikovaného US pole na propustnost membrán byl analyzován na buněčné linii HaCaT po 15′ expozice, dostatečně krátké, aby byly vyloučeny účinky vyvolané dlouhodobou sonikací. V naší studii se intenzita US pole pohybovala v rozmezí Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 a Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, tedy hluboko pod prahem kavitace24. Podle protokolu popsaného v oddílech 2.3 a 2.5 byly použity dextrany značené FITC o různé MW (MW = 10, 40 a 70 kDa), aby se pro každou intenzitu US charakterizovala indukce propustnosti membrány pro molekuly různé velikosti. Tento postup následně umožňuje vyhodnotit velikost sonoporu. Podobně jako kalcein dextrany do neošetřených buněk významně nevstupují31,32 , zatímco v režimu kavitační US může být příjem dextranů značených FITC buňkami silně zvýšen jak pomocí SP, tak podporou endosomálního obchodu30. V tomto ohledu výsledky měření průtokovou cytometrií uvedené na obr. 5 jasně ukazují vychytávání závislé na velikosti, což je jev, který nám umožňuje vyloučit souběžné působení aktivní endocytózy a podle literatury22 naznačuje SP spouštěnou nízkou intenzitou jako hlavní mechanismus podílející se na transportu molekul dextranu přes plazmatickou membránu. Konkrétně je pozorované vychytávání vyvolané SP charakterizováno prahovou hodnotou Ispta, která lineárně roste s nárůstem MW internalizovaných molekul. Pod touto prahovou hodnotou je účinnost vychytávání ošetřených buněk srovnatelná s neexponovanými buňkami. Prahové hodnoty Ispta jsou uvedeny v tabulce 1. Pro intenzity nad prahovou hodnotou se účinnost příjmu zvyšuje s nárůstem Ispta až do dosažení maxima. Pro 10 kDa dextran pak mírně klesá až k plató. Pozorovaný pokles účinnosti vychytávání při vysokých intenzitách lze vysvětlit zvýšením počtu mrtvých buněk, které jsou při oplachování ze vzorku odstraněny, a nepřispívají tak k analýzám průtokové cytometrie. Kromě toho by aktivace apoptotických procesů mohla bránit internalizaci barviva. Pozoruhodné je, že pro Ispta = 15 mW/cm2 , ačkoli je tato hodnota mnohem nižší než kavitační práh, jsou buňky schopny internalizovat 70 kDa dextrany o Stokesově průměru ~12 nm. Tuto hodnotu lze považovat za odhad minimální velikosti sonopórů vytvořených v membráně. Na obrázku S6 (oddíl 4 ESI) je uveden soubor reprezentativních fluorescenčních snímků zobrazujících vychytávání dextranů při prahové hodnotě Ispta spolu s testem PI.

Internizace PI poukazuje na významnou cytotoxickou odpověď při Ispta = 15 mW/cm2 (expoziční dávka 13,5 J/cm2). Jak uvádí Udroiu a spol.13 , za podobných experimentálních podmínek byl u buněk NIH-3T3 rovněž pozorován mírný, ale významný nárůst výskytu mikrojader v závislosti na intenzitě a době expozice 1 MHz US. Tato pozorování naznačila, že je třeba provést další studie k lepšímu pochopení biologických účinků doprovázejících membránové SP, a proto byla provedena studie biologické odezvy sonikovaných buněk v závislosti na intenzitě US.

Biologická odezva na „membránové rány“ vyvolané SP při velmi nízkých intenzitách US byla důkladně charakterizována vyhodnocením buněčné smrti pomocí kombinovaného testu AnnexinV a PI popsaného v části 2.5 (viz také část 5 ESI). Hodnotili jsme také expresi genu IL-6, cytokinu spojujícího chronický zánět s rakovinou33,34 . Výsledky analýzy průtokovou cytometrií vyjádřené v procentech buněk jsou uvedeny na obr. 6. Životaschopnost buněk je během ošetření 15′ převážně zachována (>90 %), nicméně od Ispta = 9 mW/cm2 dochází k mírnému poklesu, který je doprovázen nárůstem časných apoptotických buněk. Při Ispta = 14 mW/cm2 začíná být pozorován významný podíl nekrotických buněk, zatímco při Ispta = 16 mW/cm2 se na smrti buněk podílí i pozdní apoptóza, což odpovídá mírnému snížení nekrózy (reprezentativní bodové grafy průtokové cytometrie na obrázku S7 v ESI). Exprese genu IL-6 byla stanovena pomocí RT-PCR (obr. 7). U Ispta ≤15 mW/cm2 nebyla pozorována žádná zvýšená regulace, zatímco ošetření při 16 mW/cm2 vyvolalo nadměrnou expresi tohoto genu ve srovnání s neošetřenými buňkami.

Tato zjištění naznačují, že počínaje prahovou hodnotou Ispta 16 mW/cm2 a 15′ sonikace poškození membrány způsobené US nejen snižuje životaschopnost buněk, ale také by prostřednictvím nadměrné exprese genu IL-6 souvisejícího se zánětem mohlo vyvolat zánětlivou reakci. Vzhledem k tomu, že několik výzkumů uznalo roli zánětu při podpoře patogeneze a progrese onemocnění, jako je rakovina35,36, je zapotřebí dalšího výzkumu, aby bylo možné lépe charakterizovat aspekty související se zánětlivými vzorci.

Analýza vlivu sonikační dávky

Pro kvantitativní analýzu vztahu mezi aplikovaným US polem a pozorovanými biologickými účinky z hlediska energie dodané buňkám během expozice byla sonikační dávka vypočítána pro každé ošetření jako součin intenzity Ispta a doby expozice. Získané hodnoty jsou uvedeny v tabulce 2, kde jsou pozorované biologické účinky označeny barvami pozadí. Naše výsledky naznačují, že k SP membrán dochází od prahové dávky přibližně 6,3 J/cm2. Velikost sonopórů navíc může souviset s dávkou sonikace. Při dávkách vyšších než 10,8 J/cm2 je u ošetřených buněk pozorován pokles životaschopnosti a souběžné projevy časné apoptózy, od 14,4 J/cm2 pak následuje pozdní apoptóza, nekróza a nadměrná exprese IL-6.

Zdůrazňujeme, že tato dávka a Ispta 16 mW/cm2 odpovídá negativnímu špičkovému tlaku ~0,02 MPa. Tato hodnota se zdá být dostatečně vysoká na to, aby vyvolala mechanické napětí na rozhraní plazmatické membrány a vody, i když je o jeden řád nižší než dosud navrhovaná hodnota bezpečnostního prahu expozice (mechanický index ~0,2-0,3, při 1 MHz).

Poznamenejme, že naše experimenty byly úspěšně porovnány s experimenty provedenými pomocí elektromedicínského systému skutečně používaného při US terapii (viz také oddíl 2.2), čímž byla zdůrazněna lékařská relevance našeho přístupu. V tomto ohledu jsme přesvědčeni, že poskytnutí informace o dávce sonikace (při fixní frekvenci US) umožňuje úplnější index charakterizace buněčné odezvy na expozici US a následně jemnou identifikaci rozsahu parametrů, u nichž dochází k přechodnému SP se zanedbatelným biologickým poškozením.

Velmi důležitým krokem k pochopení biologického dopadu našich výsledků in vivo by bylo provozovat US expozici na trojrozměrných biosystémech, jako jsou lidské tkáně složené z vícenásobně poskládaných cheratinocytů nebo z endoteliálních buněk krevní mozkové bariéry

.