Abstrakt
Se stále lepšími možnostmi separace složitých vzorků a detekce neznámého materiálu se kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) široce používá ve výzkumu tradiční čínské medicíny (TCM). Tento článek popisuje principy kapalinové chromatografie (LC) a hmotnostní spektrometrie (MS) a jejich výhody a nevýhody při kvalitativní a kvantitativní analýze TCM. Vyhledali jsme výzkumnou literaturu o použití LC-MS v TCM publikovanou během posledních pěti let doma i v zahraničí. Pro lepší orientaci v analýze TCM se tento přehled zaměřuje především na kategorie aplikací LC-MS, na to, jak často se různé druhy LC-MS používají, a na kvalitativní a kvantitativní schopnosti různých LC-MS při studiu TCM.
1. Úvod
Tisíce let hromadění zkušeností o životě a nemocech, které učinili naši předkové, se nakonec promítly do moderní farmacie. Čínské byliny se složitými a různorodými složkami se obvykle uvádějí do praxe na předpis, podle pravidel panovníka, ministra, pomocníka a průvodce. Při aplikaci se množství jednotlivých bylin a farmaceutických přípravků může lišit, což může vést ke změnám v interakci mezi léčivy a účinnou látkou. V různých místech aplikace léčivých přípravků budou rozdíly ve složkách. Vzhledem ke složitosti chemického složení TCM mohou různé chemické kompozice také vzájemně reagovat. Přestože praktická aplikace prokázala účinnost TCM, je stále obtížné vysvětlit specifické léčivé účinné látky TCM v moderní vědě. V posledních letech se metabolismus sloučeniny in vivo a mechanismus účinku staly horkým tématem výzkumu čínské medicíny. Její vlastnosti, jako je komplexní složení, mechanismus víceúčelového a vícezpůsobového účinku a role složek, však dávají výzkumu TCM určitý stupeň obtížnosti.
LC-MS plně integruje vysokou separační kapacitu LC pro komplexní vzorky a silnou kvalitativní schopnost MS . Díky své vysoké citlivosti a selektivitě se technika LC-MS široce používá ve výzkumu TCM .
2. LC
Chromatografie rozděluje směs pomocí rozdílů distribučního koeficientu mezi dvěma fázemi (mobilní a stacionární fáze). Podle stavu mobilní fáze lze chromatografii rozdělit na plynovou chromatografii, kapalinovou chromatografii a chromatografii se superkritickou kapalinou, zatímco podle geometrických forem stacionární fáze lze chromatografii rozdělit na sloupcovou chromatografii, papírovou chromatografii a chromatografii na tenké vrstvě. Nejčastěji používanou LC metodou je sloupcová chromatografie, která považuje za mobilní fázi kapalinu. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je modifikována na základě klasické kapalinové sloupcové chromatografie.
Použití LC se dělí do dvou kategorií. Jedna z nich je kvalitativní nebo kvantitativní pro určité složení. Kvalitativní se řídí podle shody mezi vzorkem a cílovou složkou v čase píku . Kvantifikace se provádí podle standardní křivky vytvořené po nástřiku standardů v různých koncentračních úrovních. Dalším je otisk, který se vztahuje k pojmu, že po určitém způsobu likvidace vzorku s otiskem můžeme pomocí určitých metod analýzy získat chromatogram nebo spektrogram označený chemickou charakteristikou.
LC má velkou výhodu na schopnost oddělit složité vzorky, takže je nejefektivnější možností při použití k oddělení směsí, ale není vhodná k získání strukturních informací o materiálu . Kvalita ukončená kontrastem mezi polohami píků neznámých sloučenin a standardů není pro sledování neznámých sloučenin k dispozici.
3. MS
Masová spektrometrie je široce používána v oblasti výzkumu TCM díky své vysoké selektivitě, vysoké citlivosti a schopnosti poskytovat informace včetně relativní molekulové hmotnosti a strukturních charakteristik. MS doplňuje kvalitu pomocí molekulové hmotnosti a příslušných strukturních informací a doplňuje kvantifikaci pomocí vztahů píku a obsahu sloučeniny, kterou pík reprezentuje. Ionizace za atmosférického tlaku (API) MS má ionizaci elektrosprejem (ESI) a chemickou ionizaci za atmosférického tlaku (APCI) . Pro mnoho typů sloučenin má ESI vysokou citlivost. Ve srovnání s ESI je APCI vhodná pro méně polární sloučeniny a analýzu těkavých sloučenin. V závislosti na rozdílech mezi používanými hmotnostními analyzátory uzavírá běžná MS kvadrupólové hmotnostní spektrum (Q-MS), hmotnostní spektrum s časovým průletem (TOF-MS) a hmotnostní spektrometrie s iontovou pastí (IT-MS) .
Tandemová hmotnostní spektrometrie se týká dvou nebo více MS pracujících společně. Nejčastěji používanou tandemovou hmotnostní spektrometrií je trojnásobná kvadrupólová hmotnostní spektrometrie (QQQ-MS). Aby bylo možné použít kvadrupól k provádění vícestupňové hmotnostní spektrometrie, jsou postupně umístěny tři kvadrupóly, což je trojitý kvadrupól . Další typ tandemové hmotnostní spektrometrie, jako je kvadrupólová hmotnostní spektrometrie s časem letu (Q-TOF-MS) a kvadrupólová tandemová hmotnostní spektrometrie s iontovou pastí (Q-IT-MS), se rovněž skládá z různých kvalitativních řad analyzátorů . Řady s časovou iontovou pastí mohou dosáhnout vícestupňového MS skenování postupně v různých časech, proto tato studie zařadila IT-MS do kategorie tandemových hmotnostních spektrometrů.
Tandemová hmotnostní spektrometrie může indukovat fragmenty molekulárních iontů generovaných prvostupňovou MS, podle kterých můžeme odvodit vztah mezi potomkem a rodičem, získat strukturní informace o molekule a poté navrhnout strukturu sloučeniny a přesněji provést kvalitativní analýzu pro známé a neznámé sloučeniny.
Ačkoli MS může poskytnout strukturní informace o materiálu, vyžaduje vyšší čistotu vzorku. Ve výzkumu TCM se obvykle používá v kombinaci s LC.
4. Technika LC-MS
LC-MS, která využívá LC jako separační systém a MS jako detekční systém, nakonec dosahuje spektra. Když LC a MS pracují společně, mohou provádět vícestupňovou MS ke spekulaci struktury sloučeniny, a tím přesněji dokončit kvalitativní a kvantitativní analýzu .
Při rešerši prací o LC-MS v aplikační literatuře výzkumu TCM publikovaných během posledních pěti let doma i v zahraničí jsme zjistili, že je lze rozdělit do dvou kategorií, tj. na LC-Q-MS a LC-MS/MS. Aby bylo možné analyzovat rozdíly a výhody a nevýhody jednotlivých metod, byly práce rozděleny podle rozdílů tandemové hmotnostní spektrometrie.
4.1. LC-Q-MS
LC-Q-MS lze použít k provedení kvalitativní a kvantitativní analýzy pro standardní složky, jak je uvedeno v tabulce 1. Při provádění kvalitativní analýzy můžeme získat strukturní informace pomocí snímání kladných nebo záporných iontů . Porovnáním se standardní literaturou můžeme také objasnit, k jakému druhu látky chemická struktura patří . LC-Q-MS kvantifikuje sloučeniny na základě výběru specifických iontů pro sledování . Při absenci standardů může LC-Q-MS provádět kvalitativní analýzu látky s využitím silných kvalitativních vlastností hmotnostní spektrometrie .
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
LC-Q-MS může analyzovat látky kvalitativně, ale je třeba dále zkoumat některé izomery nebo látky se stejnou molekulovou hmotností, jejichž struktura vyžaduje další identifikaci s odkazem na vícestupňovou hmotnostní spektrometrii. Nepřesná kvalitativní analýza navíc vede ke zkreslení kvantifikace.
4.2. LC-MS/MS
4.2.1. LC-IT-MS
IT-MS zachycuje různé kvalitativní rozsahy iontů s využitím různých velikostí VF napětí přiváděného na prstencové elektrody. Má vysokou citlivost a jediná IT-MS může dosáhnout víceúrovňových funkcí hmotnostní spektrometrie .
IT-MS může realizovat časovou řadu vícestupňových MS skenů v různých chronologických pořadích, čímž poskytuje fragmentaci složek MSn; je tedy vhodná pro kvalitativní látky, poskytuje strukturní informace pro identifikaci neznámého složení, jak je uvedeno v tabulce 2. Při studiu TCM se LC-IT-MS běžně používá při kvalitativním složení .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.2. LC-QQQ-MS
Trojitý kvadrupól znamená, že jsou uspořádány tři kvadrupóly. Každý kvadrupól má samostatnou funkci. Režimy skenování trojitého kvadrupólu zahrnují režim úplného skenování, režim skenování produktových iontů, režim skenování rodičovských iontů, režim skenování neutrálních ztrát, režim skenování vybraných iontů a režim skenování monitorování více reakcí .
LC-QQQ-MS se používá hlavně pro kvantifikaci , jak je uvedeno v tabulce 3. Některé studie se používají ke kvalitativní analýze . Ve srovnání s LC-Q-Q-MS může LC-QQQ-MS vybrat konkrétní ionty ke kolizi a analyzovat fragmenty po kolizi. LC-QQQ-MS může detekovat mateřský iont a dceřiný iont současně, takže je přesná, citlivá a komplexní. LC-QQQ-MS lze použít v širším rozsahu. Ve srovnání s jinými tandemovými hmotnostními spektrometry má trojitý kvadrupól nejlepší kvantitativní reprodukovatelnost. LC-QQQ-MS je nejčastěji známou metodou kvantitativního stanovení látek.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.3. LC-Q-TOF-MS
LC-Q-TOF-MS se obecně používá ke kvalitativní analýze. Má vyšší detekční citlivost a hmotnostní rozlišení. LC-Q-TOF-MS může přesně měřit hmotnost .
LC-Q-TOF-MS se používá hlavně pro kvalitativní analýzu materiálu , jak je uvedeno v tabulce 4. Ve srovnání s několika dalšími tandemovými hmotnostními spektrometry má výhody v citlivosti detekce, přesnosti hmotnosti a rozlišení. Vysoké rozlišení a hmotnostní přesnost dávají LC-Q-TOF-MS lepší kvalitativní schopnosti pro fragmentové ionty. Kromě rozboru neznámých struktur v této metodě je také přesvědčivější při rozlišování struktury iontů a izomerů .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5. Závěry
V porovnání s LC-MS a LC-MS/MS se relativně více provádí výzkum LC-MS/MS, který má vyšší přesnost kvalitativní analýzy známých i neznámých sloučenin. LC-IT-MS má díky své schopnosti víceúrovňové hmotnostní spektrometrie lepší výkonnost při posuzování neznámé struktury složení. LC-Q-IT-MS má lepší kvalitu rozlišení než LC-IT-MS. Ve srovnání s ostatními třemi druhy LC-MS/MS bylo zjištěno, že LC-QQQ-MS se častěji používá pro výzkum a má lepší kvantitativní schopnost než ostatní. Jeho kvalitativní schopnost je dobrá, ale zatím ne tak dobrá jako LC-Q-TOF-MS. LC-Q-TOF-MS se používá především pro kvalitativní analýzu látek. Některé její schopnosti jsou poměrně vynikající, například citlivost pro detekci, hmotnostní přesnost a rozlišení.
Kvalitativní metody se mezi různými metodami LC-MS liší, zatímco kvantitativní metody jsou v podstatě stejné, protože všechny kvantitativní metody vyžadují standard o různých koncentracích. Kvantitativní metody se obvykle dělí na dva různé typy: metoda externího standardu a metoda interního standardu. Metoda externího standardu znamená, že pro provedení kvantitativní analýzy se nejprve vytvoří standardní křivka, jejíž vodorovná osa představuje koncentrace a svislá osa plochu barevného píku spektra. Poté lze podle plochy píku provést kvalitativní analýzu. Metoda vnitřního standardu znamená, že se k roztokům vzorku a hybridní referenční látky nejprve přidá vnitřní standard o známé koncentraci; poté se vytvoří standardní křivka, jejíž vodorovná osa představuje poměr koncentrace referenčního vzorku ke koncentraci vzorku vnitřního standardu a svislá osa představuje poměr plochy píku standardu k ploše píku vnitřního standardu. Nakonec se vstříkne vzorek vnitřního standardu. Podle plochy píku testovaných ukazatelů a vnitřního standardu lze provést kvalitativní analýzu.
Ve výzkumu TCM se dochází k závěru, že LC-Q-TOF-MS je lepší volbou pro kvalitativní analýzu, zatímco LC-QQQ-MS se ukazuje jako lepší pro kvantitativní analýzu. Kvantitativní analýza se provádí pomocí specifického standardu o specifické koncentraci. Kvalitativní analýza může měřit strukturu některých neznámých složek a spekulovat o jejich atribuci podle informací poskytnutých stávající výzkumnou literaturou a databází. Validace standardu je nejpřesnější pro kvalitativní materiál. Vzhledem ke složitému složení a neznámým schopnostem TCM nemohou výzkumné metody zatím relativně vyhovět. Další výzkum a zkoumání jsou stále nezbytné.
Konkurenční zájmy
Všichni autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.
Poděkování
Tato práce je podporována National Natural Science Foundation of China (č. 81273925).