Plakový test

Plakový test lze použít k purifikaci klonální populace viru nebo ke stanovení titru viru jako jednotek tvořících plaky na ml (pfu/ml), aby bylo možné při další práci použít známé množství viru k infikování buněk. Při tomto testu jsou buněčné monovrstvy infikovány nízkým poměrem viru, takže se infikují ojedinělé buňky. Překrytí agarózou udržuje buňky stabilní a omezuje šíření viru. Když každá infikovaná buňka produkuje virus a nakonec lyzuje, infikují se pouze bezprostředně sousedící buňky. Každá skupina infikovaných buněk se označuje jako plak. Neinfikované buňky obklopují plaky. Po několika infekčních cyklech začnou infikované buňky ve středu plaků lyzovat a okrajové infikované buňky zůstanou obklopeny neinfikovanými buňkami. Tento jev způsobuje, že světlo procházející infikovanými buňkami se láme jinak než okolní neinfikované buňky a plaky lze vizualizovat pouhým okem nebo světelnou mikroskopií. Každá destička představuje jeden virus. Klonální populace virů lze proto purifikovat izolací jednotlivých plaků. Jednotlivé plaky získané z různých ředění virové zásoby lze spočítat a určit tak virový titr (pfu/ml) dané transfekce nebo virové zásoby. Pro úspěch testu plaků je důležitý stav buněk a jejich rovnoměrné rozložení na povrchu destičky s tkáňovou kulturou. Buňky by měly být zdravé, > 95 % životaschopné a v době testu v logaritmické fázi růstu. Hrudkovité buňky, buňky, které nejsou rovnoměrně rozmístěny ve správné hustotě (>70 %) po destičce, a buňky, které nepřilnou k misce tkáňové kultury do 30 minut po nanesení, jsou pro test škodlivé.

Další potřebné materiály:

Plaque Assay Agarose, Cat. No. 554766
Grace’s Unsupplemented Insect Cell Medium
Fetální hovězí sérum
Miska na tkáňové kultury, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
42°C vodní lázeň

Protokol

Určete počet potřebných destiček

Pro každou ko-transfekci nebo virovou zásobu (a pozitivní kontrolu) proveďte duplikáty sériových ředění (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Každou 60mm destičku označte popisem vzorku a ředění.

Na každou 60mm destičku nasaďte kultivační destičku s hmyzími buňkami

1. Na každou 60mm destičku nasaďte 2,3 x 10 6 buněk Sf9. Jemně pohupujte destičkami dopředu a dozadu a pak ze strany na stranu, aby se buňky na povrchu destičky rovnoměrně rozložily. Nikdy deskou neotáčejte, dochází tak k nerovnoměrnému rozložení buněk. Po osazení destiček nechte buňky 30 minut až hodinu přilnout. Během této doby připravte agarový roztok a virové ředění. Vizualizujte pomocí světelného mikroskopu, abyste potvrdili >70% konfluenci a rovnoměrné rozložení buněk.

Příprava agarosového roztoku

Nasazené buňky překryjte 1% agarosovým roztokem v Grace’s Insect Cell Medium doplněném 10% FBS.

1. Nejprve vyrovnejte vodní lázeň na 42 °C. Určete celkový potřebný objem agarového roztoku: vynásobte 4 ml/plotnu počtem plakových testů. Z tohoto celkového objemu bude polovina tvořena autoklávovanou dH 2 O + agarózou, aby vznikl 2% roztok, a druhá polovina bude Grace’s Insect Media doplněná 10% FBS. Chcete-li určit množství agarosy v gramech potřebné k vytvoření konečného 1% roztoku agarózy, vynásobte celkový objem číslem 0,01. (Například 10 destiček x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 g.)
2. Přidejte příslušné množství autoklávované dH 2 O do sterilní skleněné lahve vhodné velikosti. Poté POMALU přidejte vypočtené množství agarózy, přičemž jemně otáčejte, aby se dH 2 O a agaróza promíchaly. Směs ohřejte v mikrovlnné troubě, dokud nezačne vřít. Vyjměte láhev a zkontrolujte, zda ve směsi není nerozpuštěná agaróza. Pokud je nějaká přítomna, pokračujte v zahřívání. Postup opakujte, dokud se agarosa zcela nerozpustí (POZOR: směs a doprovodná pára jsou velmi horké a mohou popálit. Použijte vhodné bezpečnostní pomůcky/opatření). Po úplném rozpuštění agarózy láhev volně uzavřete a přeneste do vodní lázně o teplotě 42 °C. Nechte směs vychladnout na 42 °C.
3. Přidejte Grace’s Insect Media a přidejte fetální hovězí sérum na 10 %. Příklad: Na 100 ml Grace’s Insect Media přidejte 10 ml FBS. Umístěte směs Grace’s Media + 10% FBS do vodní lázně o teplotě 42 °C.

Připravte sériová ředění virů

1. Pro každou ko-transfekci označte šest 15 ml sterilních zkumavek od 10 -1 do 10 -6 příslušným popisem vzorku. Do každé zkumavky přidejte 2,7 ml média TNM-FH. Do první zkumavky přidejte 0,3 ml supernatantu z ko-transfekce, zkumavku promíchejte. Proveďte sériové ředění přenesením 0,3 ml do následujícího ředění, přičemž pokaždé použijte čerstvou pipetu.

Infekce monovrstevných buněk

1. V tomto okamžiku měly buňky dostatek času přilnout k povrchu destičky. Zkontrolujte několik destiček pod světelným mikroskopem, abyste potvrdili 70% konfluenci a rovnoměrné rozložení buněk.
2. Pracujte s duplicitními destičkami každého ředění a opatrně odsajte médium z buněk pomocí sterilní 200 µl pipetové špičky a vakua. Neporušujte buněčný list. Přidejte 1 ml příslušného virového ředění na každou z duplikátních destiček a jemně pohupujte destičkou sem a tam, pak ze strany na stranu, aby se virus rovnoměrně rozprostřel. Opakujte se všemi odpovídajícími destičkami a ředěními.
3. Při pokojové teplotě ve sterilní digestoři každých 15 minut po dobu 1 hodiny jemně rozkmitejte destičky.

Překryjte infikované buňky agarózou

1. Po 1 hodině zkontrolujte, zda má roztok agarózy teplotu 42 °C. Roztok by měl být dostatečně teplý, aby byl stále v tekutém stavu, ale měl by být dostatečně chladný, aby se dal držet rukou. Pokud lahvičku nemůžete pohodlně držet, je roztok příliš horký a zabije buňky Sf9. Zkontrolujte, zda má Grace’s Insect Media w/ 10% FBS teplotu 42 °C. Pokud ano, přidejte k roztoku agarózy stejný objem, abyste doplnili konečný roztok agaru. Konečný roztok agaru dobře promíchejte.
2. Jakmile je roztok připraven, umístěte jej do skleněné kádinky naplněné vodou z vodní lázně. To by mělo zabránit tuhnutí roztoku, zatímco jej budete používat pod kapotou. Během postupu pravidelně kontrolujte teplotu vody v kádince. Pokud začíná chladnout, nahraďte ji teplou vodou z vodní lázně.
3. Pracujte vždy s jedním párem duplikátů a opatrně odsajte médium z buněk pomocí sterilní 200 µl pipetovací špičky a vakua. Neporušujte buněčný list. Při odsávání mírně naklopte destičku a odsajte supernatant z okraje destičky. To umožní optimální aspiraci bez narušení buněčného listu. Poté pomalu přidejte na každou destičku 4 ml agarového roztoku a nechte agar ztuhnout.
4. Jakmile agar na všech destičkách ztuhne, opatrně umístěte destičky do čisté, vzduchotěsné inkubační komory. Komoru zvlhčete umístěním sterilní gázy a 10 ml sterilní vody do kultivační misky o průměru 10 mm na spodní stojan inkubační komory. Komoru uzavřete a umístěte do inkubátoru o teplotě 27 °C. Nechte destičky inkubovat po dobu 6 – 10 dnů.
5. Destičky lze vizualizovat obrácením destiček na tmavé pozadí a jejich osvětlením silným zdrojem světla ze strany destičky nebo jejich podržením pod úhlem 45° do zdroje světla. Když se učíte identifikovat destičky, zakroužkujte možné destičky fixem. Pomocí světelného mikroskopu vizualizujte při nízkém výkonu, abyste potvrdili, že v trávníku buněk je oblast projasnění. Vizualizujte při vysokém výkonu a hledejte infikované buňky na okraji projasnění, poté méně infikované buňky, jak se vzdalujete od oblasti projasnění.
6. Pro usnadnění vizualizace plaků překryjte 3 ml 0,5% agarózy (připravené podle předchozího popisu) obsahující 50 µg/ml neutrální červeně. (Připravte si zásobní roztok neutrální červeně (Sigma N7005) v koncentraci 1 mg/ml ve vodě nebo PBS. Filtrujte, sterilizujte a uchovávejte při teplotě 4 °C ve tmě.) Nechte ztuhnout a inkubujte destičku přes noc při 27 °C. Neutrální červeň obarví zdravé buňky a plaky se objeví jako jasné oblasti o průměru přibližně 0,5 – 3 mm na bílém pozadí. Protože neutrální červeň je životně důležité barvivo, je důležité barvit, dokud je buněčná monovrstva zdravá, tj. 4 až 7 dní po infekci.

Purifikace plaků z virové zásoby

Pro zajištění správné izolace je nejlepší, aby byly plaky odebrány z destiček obsahujících méně než 50 plaků. Na destičky naneste několik ředění viru, abyste zajistili získání dostatečně nízkého počtu plaků. Plaky lze odebírat pomocí sterilních mikropipetových špiček (1 000 µl) nebo mikrokapilárních zkumavek.

Množení viru z odebraných plaků

1. Plaky pod plakem označte značkou. Pomocí sterilní špičky pipety odstraňte agarózovou zátku přímo nad plakem. Tímto způsobem odeberte 10 až 100 plaků.
2. Každou agarózovou zátku vložte do samostatné mikrocentrifugační zkumavky obsahující 1 ml média pro tkáňové kultury. Vylučte virové částice z agarózy otáčením zkumavky přes noc při 4 °C.
3. Přidejte 200 µl každého odebraného plaku do samostatných jamek 12jamkové destičky s tkáňovou kulturou osazené 2 x 10 5 buňkami na jamku v 1 ml čerstvého média TNM-FH. Inkubujte destičky po dobu 3 dnů při teplotě 27 °C.
4. Supernatant viru z této zásoby pasáže jedna lze odebrat a odstřeďovat po dobu 5 minut při 1000 x g při teplotě 4 °C, aby se odstranily zbytky. Uchovávejte při teplotě 4 °C.
5. Pro každý izolát plaku osázejte 100mm destičku tkáňové kultury 5 x 10 6 buňkami. Nechte buňky přilnout a vyměňte médium za 10 ml čerstvého média TNM-FH.
6. Přidejte 200 µl zásoby pasáže jedna na 100 mm destičku a inkubujte při 27 °C po dobu 4 dnů. Zbývajících 800 µl zásoby passage-one uchovávejte při 4 °C jako zálohu.
7. Sbírejte virový supernatant a odstřeďte jej, abyste odstranili zbytky. Stanovte titr této zásoby pasáže dvě. Pokud titr zůstane nižší než 2 x 10 8 pfu/ml, přejděte k amplifikaci bakuloviru.