Příběh DNA

V tomto měsíci uplynulo 50 let od objevu struktury DNA. Sága však začala o mnoho let dříve, říká Susan Aldridgeová

Dne 25. dubna 1953 vyšel v časopise Nature článek, který měl změnit vědy o živé přírodě – od biochemie a zemědělství až po medicínu a genetiku. James Watson a Francis Crick, tehdy působící na Cambridgeské univerzitě, oznámili objev struktury DNA (deoxyribonukleové kyseliny) – molekuly, z níž se skládají geny.

Crick a Watson použili k odhalení dnes již proslulé dvojité šroubovice DNA konstrukci modelů, ale rozhodující význam pro objev měla rentgenová krystalografická data Rosalindy Franklinové a Maurice Wilkinse z King’s College v Londýně. Za tento průlom vděčíme také pokroku v biochemických technikách, mikroskopii, chemické analýze a teoriím chemických vazeb, které se rozvíjely od poloviny 19. století. Skutečný význam struktury DNA podtrhlo přibližně ve stejné době konečné vyřešení desítky let trvajícího sporu o to, zda je „molekulou života“ DNA, nebo bílkovina.

Sága DNA začala v roce 1869, kdy švýcarský biochemik Friedrich Miescher izoloval novou látku z jader bílých krvinek. Vědci si nedávno uvědomili, že buňky jsou základní jednotkou života, a Miescher se zajímal o jejich chemické složky. Každé ráno volal na místní kliniku, aby si vyzvedl špinavé obvazy, protože v dobách před antiseptiky byly tyto obvazy nasáklé hnisem – dobrým zdrojem bílých krvinek s jejich velkými jádry. Přidáním alkálií se buněčná jádra roztrhla a uvolnila svůj obsah, z něhož Miescher extrahoval DNA (kterou nazval nuklein).

Analýza tohoto nukleinu ukázala, že se jedná o kyselinu, která obsahuje fosfor, takže nepatří do žádné ze známých skupin biologických molekul, jako jsou sacharidy a bílkoviny. Miescher vypočítal jeho vzorec jako C29H49O22N9P3 – což bylo značně podhodnocené číslo, odrážející skutečnost, že DNA je dlouhá, křehká molekula, která se snadno fragmentuje. Miescher musel pro určení vzorce použít jeden z fragmentů. Nuklein byl překřtěn na nukleovou kyselinu a navzdory jeho chemické novosti si jeho biologický význam plně uvědomil až po mnoha dalších desetiletích.

Mezitím díky rozvoji mikroskopie buňka nadále vydávala svá tajemství. V roce 1879 objevil německý biolog Walther Flemming v jádře drobné nitkovité struktury zvané chromatin (později známé jako chromozomy) – takzvané proto, že snadno absorbovaly barvu z nových barviv používaných k odhalení buněčných složek. Studie buněčného dělení měly odhalit klíčovou roli, kterou chromozomy hrají v dědičnosti – jak se zdvojují před rozdělením buňky a poté se dělí na dvě sady, přičemž do každé „dceřiné“ buňky se dostane nová kopie.

Další analýzy naznačily, že chromozomy obsahují DNA, což vedlo dalšího německého badatele Oskara Hertwiga k prohlášení, že „nuklein je látka, která je zodpovědná … za přenos dědičných vlastností“. Ne všichni s tím souhlasili – například Miescher. Chromozomy obsahovaly také bílkoviny a biochemici si teprve začínali uvědomovat, jak velké a složité molekuly bílkoviny jsou. Křehkost DNA měla zakrýt její základní složitost na mnoho dalších let.

Ironicky řečeno, Miescher byl pravděpodobně první, kdo vyslovil myšlenku chemického kódu předávajícího biologickou informaci z jedné buňky do druhé, ale stejně jako mnoho dalších po něm se domníval, že nositelem takového kódu jsou pouze bílkoviny.

V roce 1900 bylo známo, že základními stavebními kameny DNA jsou fosfát, cukr (později se ukázalo, že je to deoxyribóza) a čtyři heterocyklické báze – dvě z nich jsou puriny, zatímco další dvě jsou pyrimidiny .

Byl to Phoebus Levene z Rockefellerova institutu v New Yorku a bývalý student ruského chemika a skladatele Alexandra Borodina, který ukázal, že složky DNA jsou propojeny v pořadí fosfát – cukr – báze. Každou z těchto jednotek nazval nukleotidem a tvrdil, že molekula DNA se skládá z řetězce nukleotidových jednotek spojených fosfátovými skupinami, které tvoří „páteř“ molekuly.

Ale až do konce 20. století nikdo nedocenil mimořádnou délku molekuly DNA. Nyní víme, že DNA z jedné lidské buňky, pokud by byla položena konec na konec, by tvořila molekulu o délce přibližně 1 m. Dokonce i tak jednoduchý organismus, jako je bakterie E. coli, má molekulu DNA dlouhou něco přes 1 mm. Miescher si to samozřejmě neuvědomil, stejně jako Levene, který trval na tom, že DNA je relativně malá molekula – pravděpodobně dlouhá asi 10 nukleotidů.

Levene byl také přesvědčen, že množství čtyř bází je stejné ve všech molekulách DNA bez ohledu na jejich původ. Takže i když švédští vědci Torbjörn Caspersson a Einar Hammersten ve 30. letech 20. století prokázali, že DNA je polymer, většina lidí nadále věřila Leveneho „tetranukleotidové hypotéze“. I kdyby DNA obsahovala miliony nukleotidů, domnívali se, že jsou uspořádány monotónním a předvídatelným způsobem, který nemůže mít žádný smysluplný informační obsah. Leveneho současník, významný německý chemik Emil Fischer, ukázal, že bílkoviny jsou tvořeny aminokyselinami, které jsou vzájemně propojeny v různých sekvencích. Stále více to vypadalo, že proteiny jsou nositeli genetického kódu, zatímco DNA hraje podpůrnou roli v chromozomech.

Průlom přinesl Oswald Avery, Colin McLeod a Maclyn McCarty, tým lékařských mikrobiologů z Rockefellerova institutu v New Yorku. Snažili se určit povahu „transformačního principu“ – látky, kterou v roce 1928 objevil anglický mikrobiolog Fred Griffith. Griffith experimentoval se dvěma druhy pneumokoků, bakterií způsobujících zápal plic (v dobách před antibiotiky velmi obávaných).

Jedna forma – známá jako hladká forma podle svého vzhledu při kultivaci na Petriho miskách – byla známá jako patogenní, zatímco druhá, „drsná“ forma byla neškodná. Ke svému překvapení Griffith zjistil, že smícháním živých drsných bakterií s usmrcenými hladkými pneumokoky lze drsné pneumokoky přeměnit na virulentní hladkou formu. Zřejmě nějaká látka – transformační princip (jinými slovy geny) – přešla z hladkých bakterií na drsné bakterie. Pomocí enzymů, které rozkládají specifické buněčné složky, Avery a jeho tým vylučovací metodou prokázali, že transformačním principem není protein, ale DNA.

Do této debaty přispěli i fyzikové – například Erwin Schr?dinger ve své vlivné knize Co je život předložil koncept „aperiodického krystalu“. Jednoduché krystaly, jako je chlorid sodný, nemohou nést genetickou informaci, protože jejich ionty jsou uspořádány periodicky. Schr?dinger navrhoval, aby se „plán“ života nacházel ve sloučenině, jejíž složky jsou uspořádány v dlouhém nepravidelném sledu, který nese informaci v podobě genetického kódu zakotveného v její chemické struktuře. Bílkoviny byly zřejmým kandidátem na aperiodický krystal, jehož kód tvořila sekvence aminokyselin. Nyní, po Averyho objevech, se pozornost upřela na DNA jako alternativní volbu pro genetický materiál.

Výzkum zaměřený na určení struktury DNA nabyl na naléhavosti (i když konečné potvrzení její ústřední role mělo teprve přijít, a to na základě experimentů provedených Alfredem Hersheym a Martou Chaseovou v USA na počátku 50. let 20. století). Například na rakouského chemika Erwina Chargaffa Averyho práce hluboce zapůsobila. Napsal: „Viděl jsem před sebou v temných obrysech počátek gramatiky biologie. Avery nám dal první text nového jazyka, nebo nám spíše ukázal, kde ho hledat. Rozhodl jsem se, že tento text budu hledat. Chargaff byl průkopníkem papírové chromatografie nukleových kyselin, pomocí níž určil, kolik jednotlivých složek nukleotidů je obsaženo ve vzorku DNA. Rychle tak zbořil Leveneho tetranukleotidovou hypotézu. Jednotlivé druhy se lišily množstvím A, C, G a T – ale v rámci druhu jsou jejich podíly shodné bez ohledu na to, z jaké tkáně je DNA extrahována. Bylo to přesně to, co se dalo očekávat u molekuly, která je biologickým podpisem pro daný druh.

Ještě významnější byl další Chargaffův objev, že podíl A v jakékoli molekule DNA se vždy rovná podílu T a stejně tak vždy odpovídá množství G a C – pravidlo, které se stalo známým jako Chargaffovy poměry. Ačkoli se zdá, že Chargaff sám své poznatky přímo nevyužil, myšlenka párování bází (A s T, C s G) měla být klíčovým krokem při sestavování trojrozměrné struktury DNA.

Závěrečná fáze řešení hádanky struktury DNA se opírala o rentgenovou krystalografii. Používání rentgenového záření k řešení struktur velkých biologických molekul začalo prací Dorothy Hodgkinové na penicilinu, lysosymu a vitaminu B12 a prací Maxe Perutze na hemoglobinu z 30. let 20. století. V roce 1938 měl William Astbury, žák Williama Bragga (který se synem Lawrencem tuto techniku v roce 1913 vynalezl), rentgenové snímky DNA, které však bylo obtížné interpretovat.

Na konci 40. let 20. století se strukturou DNA intenzivně zabývaly tři samostatné skupiny. Na King’s College v Londýně zaujala Maurice Wilkinse dlouhá vlákna, která DNA vytváří, když je skleněnou tyčinkou vytažena z vodného roztoku, a zajímalo ho, zda to znamená, že v její struktuře existuje nějaká pravidelnost. Vytvořil další rentgenové snímky pomocí provizorních přístrojů, jejichž podobu si dnes lze jen těžko představit. V roce 1951 se k Wilkinsovi připojila Rosalind Franklinová, britská fyzikální chemička, která již měla mezinárodní renomé díky své práci na rentgenové krystalografii uhlí. Pustila se do budování speciální rentgenové laboratoře v King’s a brzy začala vytvářet nejlepší snímky DNA, jaké kdy byly pořízeny. Ty ji přivedly na myšlenku, že molekula DNA je možná stočená do šroubovice.

Linus Pauling, americký chemik a autor knihy The nature of the chemical bond, začal uvažovat podobně. Pauling ostatně již dříve objevil šroubovicové motivy ve strukturách bílkovin. Přibližně v té době spojili v Cavendishově laboratoři v Cambridgi své síly Francis Crick – s matematickým a fyzikálním vzděláním, a mladší James Watson s odbornými znalostmi v oblasti molekulární biologie fágů (virů infikujících bakterie, které se tehdy používaly jako laboratorní nástroj pro genetické studie), kteří měli v úmyslu rozlousknout strukturu DNA sami pomocí přístupu založeného na vytváření modelů.

Měli představu, že struktura DNA musí umožňovat, aby se molekula během buněčného dělení kopírovala, a do každé nové buňky tak mohla přejít přesná kopie jejího kódu – který byl opět zakotven ve struktuře. Návštěva Chargaffa v Cavendishe v roce 1952 podnítila další myšlenku, že by snad posloupnost bází mohla představovat geny v chemickém kódu. Mezitím Pauling publikoval článek o struktuře DNA, který však obsahoval zásadní chybu (fosfátové skupiny umístil na vnitřní stranu). Vstup tohoto vědeckého velikána do závodu povzbudil Cricka a Watsona k většímu úsilí, zatímco Wilkins a Franklin si příliš nerozuměli a v práci s DNA příliš nepokročili.

Zásadní okamžik nastal, když Wilkins ukázal Watsonovi jednu z Franklinových fotografií tzv. formy B DNA. Předchozí studie používaly formu A, která obsahuje méně vody a vedla k těžko analyzovatelným snímkům. Tento obrázek byl naproti tomu krásně jednoduchý a zdálo se, že jasně ukazuje na šroubovicovou strukturu molekuly. Jak uvádí Watson ve svých slavných pamětech: V okamžiku, kdy jsem ten obrázek uviděl, se mi otevřela ústa a rozbušilo srdce.

Stavba modelu – s použitím kovových destiček pro nukleotidy a tyčinek pro vazby mezi nimi – nyní začala naplno. Crick a Watson však nevěděli, zda mají svou šroubovici stavět s fosfáty uvnitř nebo vně, a nebyli si jisti, jak začlenit Chargaffovy myšlenky o párování bází.

Poslední vodítko přišlo od dalšího návštěvníka Cavendishe, amerického chemika Jerryho Donohuea, který poukázal na to, jak vodíková vazba umožňuje, aby se A vázalo na T a C na G. To umožňuje vytvořit dvoušroubovicovou strukturu DNA, kde obě vlákna mají báze uvnitř, spárované, a fosfáty vně.

Skutečná krása modelu, který Crick a Watson sestrojili, spočívala v tom, že struktura okamžitě naznačovala funkci. Jak naznačili ve svém článku v časopise Nature: „Neuniklo nám, že specifické párování, které jsme postulovali, naznačuje možný mechanismus kopírování genetického materiálu“.

Molekula DNA je samoreplikující se (jak bylo prokázáno pokusy o několik let později), protože se může rozbalit na dvě jednotlivá vlákna. Každá báze pak přitahuje svou komplementární bázi pomocí vodíkové vazby, takže se sestaví dvě nové dvojité šroubovice.

Franklin a Wilkins si zásluhy o strukturu DNA nenechali zcela ujít; jejich vlastní samostatné práce byly publikovány zády ke Crickově a Watsonově práci ve stejném čísle časopisu Nature. Crick, Watson a Wilkins pak za svou práci získali v roce 1962 Nobelovu cenu (Franklin zemřel v roce 1958 ve věku 37 let na rakovinu).

Objev struktury DNA byl počátkem nové éry v biologii, která během následujících dvou desetiletí vedla k rozluštění genetického kódu a k poznání, že DNA řídí syntézu bílkovin. Došlo také k technickému pokroku, jako je sekvenování DNA, genetické inženýrství a klonování genů. V nedávné době byly vyřešeny kompletní sekvence mnoha organismů – včetně lidského genomu v červnu 2000. Příštích 50 let příběhu DNA bude především o realizaci praktických přínosů Crickova a Watsonova objevu pro lidstvo – v průmyslu, medicíně, potravinářství a zemědělství.

Zdroj: Chemistry in Britain

Poděkování

Susan Aldridgeová

Další četba