Objev vodních kanálů (akvaporinů)

Abstrakt

Pohyb vody do buněk a z buněk je základní biologický proces, který je nezbytný pro život. Tento pohyb vody nejen reguluje činnost jednotlivých buněk, ale je také zodpovědný za fungování mnoha orgánových systémů a za udržování vodní rovnováhy celého těla. Dlouho se předpokládalo, že pohyb vody přes biologické buněčné membrány je nějakým způsobem zesílen nebo usnadněn póry nebo kanály, ale hledání těchto kanálů bylo dlouhé a únavné. Jak už to ve vědě bývá, tajemství vodního kanálu nakonec náhodou objevil v roce 1992 Peter Agre a jeho kolegové z Univerzity Johnse Hopkinse v Baltimoru, kteří se zabývali bílkovinami membrán červených krvinek. Tento „první“ vodní kanál byl původně pojmenován CHIP28 a nyní je znám jako aquaporin 1. Agre za tento objev obdržel v roce 2003 Nobelovu cenu za chemii. V současné době je u savců známo 13 akvaporinů, které jsou rozmístěny ve většině tkání, ale u nižších organismů a v rostlinné říši jich bylo identifikováno mnohem více. Zapojení akvaporinů do procesů, jako je koncentrace moči a homeostáza tělesných tekutin, funkce mozku, sekrece žláz, hydratace kůže, plodnost mužů, sluch, zrak a většina důležitých tělesných funkcí, které si lze představit, jsou nyní předmětem intenzivního vědeckého zkoumání. Defekty ve funkci akvaporinů navíc souvisejí s různými chorobnými stavy a patologickými stavy. Tento stručný přehled pojednává o jejich původu, objevu a funkci ve vybraných tělesných procesech, zejména se zaměřením na hydrataci.

© 2017 The Author(s) Published by S. Karger AG, Basel

Proč se zajímáme o vodní kanály?

Buňky, které tvoří naše tělo, jsou z větší části tvořeny vodou. Přibližně 65 % buňky tvoří voda. Z hlediska celkové tělesné hmotnosti jsou nejvíc „šťavnaté“ děti, které se skládají ze 75 % vody; štíhlí dospělí obsahují 60 % vody, zatímco starší dospělí jen 50 % vody. Převážnou část nevodní, suché hmotnosti v těle tvoří kosti. Pro srovnání, snad nejvodnatějším organismem je salát (95 % vody), zatímco my lidé jsme srovnatelní s banánem (65 % vody). Během evoluce se buňky všech organismů vyvinuly tak, aby optimálně fungovaly v takovém vodním prostředí, a výrazné odchylky v obsahu vody v buňkách koncentrují nebo ředí jejich molekulární složky a brání normální funkci. Buňky tedy potřebují regulovat množství vody, které vstupuje a odchází přes jejich plazmatickou membránu, aby mohly regulovat cytosolickou koncentraci rozpuštěných látek, iontů, elektrolytů, proteinů a nukleových kyselin. Kromě toho je přísně kontrolováno také množství vody v extracelulárních prostorech uvnitř organismu. U člověka a dalších savců se jedná mimo jiné o objem krve, intersticiální prostor mimo cévy, mozkomíšní mok, vodnatý humor v oku a žlázové sekrety.

Proč potřebujeme vodní kanály?

Aby se buňky vyrovnaly s neustále se měnícími metabolickými požadavky a okolními podmínkami, musí rychle vyměňovat vodu mezi svou cytoplazmou (uvnitř) a vnějším prostředím (venku), aby si udržely stálý objem. To je důležité pro mnoho nižších organismů, které si vyvinuly propracované mechanismy pro regulaci objemu buněk, a obvykle zahrnuje nejen transport vody, ale také toky iontů (hlavně Na+, K+ a Cl-) přes membrány, aby se zotavily z nadměrného bobtnání nebo smršťování, když jsou vystaveny vnějším tekutinám s různou osmolalitou (např. od slané mořské vody po zředěnou dešťovou vodu) . I když tyto mechanismy transportu iontů existují i u savců, většina regulačních „homeostatických“ funkcí u vyšších organismů je dosahována udržováním stálého vnitřního prostředí, ve kterém naše buňky pobývají – slavné „milieu intérieur“ neboli „vnitřní moře“ definované Claudem Bernardem . Toho je z velké části dosaženo činností ledvin, které v koordinaci s mozkem snímají objem a koncentraci plazmy (osmolalitu) a následně reagují zvýšením nebo snížením množství vody, kterou uvolňují do moči. O tom bude podrobněji pojednáno níže.

Kromě udržování objemu buněk umožňuje rychlá výměna vody v buňkách tkáním a orgánům vylučovat a/nebo vstřebávat vodu jako součást jejich fyziologické funkce. Epitelové buňky vystýlající některé ledvinové tubuly jsou k této funkci obzvláště dobře uzpůsobeny, ale buňky v jiných orgánových systémech mohou také regulovat transepiteliální pohyb vody, aby umožnily probíhat funkčně důležité procesy. Například tekutiny vylučované slinivkou břišní, žlučovodem, slznými, slinnými a mléčnými žlázami, stejně jako cévnatkou a pigmentovým epitelem sítnice, zahrnují rychlý transepiteliální pohyb vody.

Jak se voda pohybuje do buněk a z buněk?

Všechny tyto fyziologické procesy zahrnují pohyb vody přes buněčné membrány. Již dlouho je známo, že když se většina buněk umístí do destilované vody, značně nabobtnají a nakonec mohou prasknout. Naproti tomu, když jsou buňky umístěny do roztoku soli, který je koncentrovanější než soli a další složky v jejich cytoplazmě, zmenší se. Tento proces je z velké části způsoben osmotickým tokem vody nahoru nebo dolů po koncentračním gradientu ve snaze systému vyrovnat osmotickou koncentraci na obou stranách buněčné plazmatické membrány. Jak přesně se ale voda přes buněčnou membránu pohybuje? Pomocí speciálního zařízení, které dokáže měřit bobtnání a smršťování červených krvinek, což je experimentální model, který lze snadno získat a manipulovat s ním, dospěli vědci k závěru, že voda má přes membrány dvě cesty. Při sledování osmotického bobtnání a smršťování při různých teplotách objevil Solomon pomalý proces citlivý na teplotu, na který byl navršen mnohem rychlejší proces nezávislý na teplotě (obr. 1). Pomalý proces odrážel difuzní propustnost vody přes tukovou lipidovou dvojvrstvu plazmatické membrány – difuze je citlivá na teplotu. Rychlý proces však odpovídal přítomnosti vodních pórů v membráně, které umožňovaly rychlejší, osmoticky podmíněný průchod vody, který nezahrnoval difuzi (obr. 1). Macey a Farmer a další pak ukázali, že sloučenina chlorid rtuťnatý může výrazně inhibovat rychlou složku tohoto procesu, což naznačuje přítomnost proteinového póru – nebo vodního kanálu – v membráně. Chlorid rtuťnatý se váže na sulfhydrylové skupiny (cysteinové zbytky) na bílkovinách a inhibuje jejich funkci: v tomto případě propustnost vody. Tento výzkum, který se zaměřil na červené krvinky, tedy jasně ověřil koncept, že vodní póry jsou zodpovědné za rychlý, teplotně necitlivý a osmoticky podmíněný průchod vody přes biologické membrány. Jak uvidíme, tyto póry byly následně identifikovány jako akvaporiny.

Ledviny regulují obsah vody v našem těle

Ledviny jsou pozoruhodný orgán, který je známý především tím, že „filtruje“ krev a odstraňuje odpadní produkty, jako je močovina a další toxiny, a produkuje moč. Denně se přefiltruje přibližně 180 l krve, přesto většina jedinců vyprodukuje pouze asi 1,5 l moči. Přesné množství závisí na tom, kolik pijete, jaké je horko a kolik cvičíte (což způsobuje ztrátu vody pocením). Přibližně 90 % filtrované tekutiny je odstraněno v proximálních oblastech ledvin a tato hodnota je u většiny lidí poměrně stálá. Zbylých 10 % (18 l) se však zpětně vstřebává ve sběrném kanálku ledvin pod vlivem antidiuretického hormonu vazopresinu (VP). VP je uvolňován zadní částí hypofýzy v reakci na dehydrataci (která vede ke zvýšení osmotické koncentrace séra) nebo objemovou ztrátu. Působí na epitelové buňky sběrných kanálků ledvin prostřednictvím specifického receptoru zvaného vazopresinový receptor (V2R) a stimuluje reabsorpci vody, čímž dochází k nápravě problému a obnově koncentrace a/nebo objemu krve na normální úroveň. Mechanismus, kterým VP způsobuje tuto absorpci tekutiny přes epitel sběrných kanálků, je nyní poměrně dobře znám a zahrnuje vodní kanály aquaporinů.

Močový měchýř ropuchy jako model ledvin

Je vhodné udělat krok zpět a podívat se, jak byl mechanismus účinku VP zkoumán experimentálně. Zatímco účinky VP na funkci ledvin byly již nějakou dobu dobře známy, detailní rozbor jeho buněčného působení vyžadoval modelový systém, který byl dostupnější než ledviny. Práce s jednotlivými ledvinovými tubuly je velmi obtížná (ale ne nemožná), protože jsou velmi malé – mají průměr jen asi 40 µm. Zásadní průlom ve výzkumu nastal, když Bentley (a další) zjistil, že močový měchýř ropuchy také transportuje vodu v reakci na antidiuretický hormon . To je přirozenou součástí jejich procesu přežití v přírodě. Když se ropucha ponoří do vody, vstřebává kůží vodu a produkuje velké množství velmi zředěné moči, kterou ukládá do velkého balónovitého měchýře. Když má ropucha omezený přístup k vodě v rybníce a začne se vysušovat, uvolní se její vlastní antidiuretický hormon (tzv. vazotocin, analog VP), který způsobí, že epitel močového měchýře začne být propustný pro vodu. Voda uložená v močovém měchýři se tak vrací do krve, aby se zvíře rehydratovalo. Ropucha si v podstatě nosí v močovém měchýři svou vlastní balenou vodu. Močový měchýř ropuchy se tak stal široce používanou náhražkou pro zkoumání a pochopení VP indukovaného toku vody přes epitel sběrných kanálků ledvin .

Po mnoho let byl močový měchýř ropuchy používán ke zkoumání počátku a posunu působení VP na tok vody přes epitelové buňky. Bylo identifikováno mnoho buněčných signálních drah, které regulují tento proces za interakcí VP-receptor. Jedním z nejzajímavějších poznatků, které vyplynuly z mnoha studií žabího měchýře, byl koncept vodních kanálků, které se vkládají do plazmatické membrány těchto epiteliálních buněk za účelem zvýšení membránové, a tedy i epiteliální propustnosti vody. Po vysazení hormonů by pak tyto „vodní kanály“ byly odstraněny z plazmatické membrány internalizací do buňky (proces známý jako endocytóza), což by obnovilo membránu do výchozího nepropustného stavu a zabránilo průtoku vody. Tuto myšlenku publikoval Wade, který vymyslel termín „hypotéza raketoplánu“, aby popsal pohyb vodních kanálků tam a zpět k povrchu buňky a zpět na základě analogie s raketoplánem NASA. Povaha těchto vodních kanálů však zůstávala neznámá.

Objev vodních kanálů akvaporinů

Přes mnoho pokusů o identifikaci proteinu, který vytvářel vodní kanály, byla tato oblast na mnoho let v podstatě zmrazena v čase. Všechny cílené pokusy o izolaci proteinu z purifikovaných membrán erytrocytů z močových měchýřů ropušnic a z ledvin se setkaly s omezeným úspěchem, i když některé publikace se k němu přiblížily a jiné poskytly důležité informace, například informace o velikosti molekuly (asi 30 kD) . A tak se stalo, že Agreho skupina při zkoumání proteinů Rhesus faktoru v membránách červených krvinek zaznamenala na svých gelech konzistentní „kontaminující“ pás o velikosti kolem 28 kD . Místo aby tuto informaci zavrhli, zapátrali trochu hlouběji a dospěli k závěru, že by se mohlo jednat o tolik hledaný vodní kanál v červených krvinkách. Izolovali a přečistili jej a protilátky ukázaly, že je exprimován také v buňkách proximálních tubulů ledvin a tenkého sestupného Henleova raménka – oba jsou konstitutivně vysoce propustné pro vodu. Mohl by to být vodní kanál? Rozhodující okamžik nastal, když Agreho skupina vstříkla mRNA kódující tento protein do expresního systému in vitro, oocytů Xenopus. Membrána oocytů je za normálních okolností pro vodu velmi nepropustná – vajíčka se ukládají do sladké vody a při propustnosti membrány by praskla! Ale po injekci mRNA kódující domnělý vodní kanál oocyty vhozené do destilované vody přesně toto udělaly – praskly, zatímco kontrolní oocyty zůstaly neporušené . Agreho skupina si uvědomila, že vstříknutá mRNA donutila oocyty produkovat nový protein, který po přesunu do membrány oocytu pomocí buněčných transportních mechanismů způsobil, že se membrána stala vysoce propustnou pro vodu. Následovala velká oslava. Řada následných prací potvrdila, že tento nový protein, nazvaný CHIP28 (channel-forming integral membrane protein of 28 kD), byl prvním definitivně identifikovaným vodním kanálem .

Rodina akvaporinů

Brzy poté, co se stala známou molekulární identita CHIP28, našli jiní řadu homologních proteinů, které vytvořily novou rodinu. Staly se známými jako akvaporiny . V době, kdy byl tento název poprvé použit, byly u savců známé 4 akvaporiny – AQP1, 2, 3 a 4. AQP1 a AQP2 byly označeny jako akvaporiny. Nyní je známo 13 savčích akvaporinů a stovky jich byly identifikovány u jiných organismů včetně rostlin . Všechny mají stejné celkové strukturní rysy, s molekulovou hmotností přibližně 30 kD v neglykosylované formě a několika různými stavy glykosylace, které vedou k vyšší molekulové hmotnosti. Všechny mají 6 transmembránových domén; C- i N-konec se nacházejí v cytoplazmě; v lipidové dvojvrstvě tvoří funkční tetramer a struktura vodního póru uvnitř proteinu byla u některých akvaporinů objasněna pomocí rentgenové krystalografie . Některé akvaporiny jsou nečekaně propustnější pro vodu než jiné a některé mohou kromě vody přenášet i jiné molekuly. Například AQP3 je propustný pro glycerol a AQP9 je propustný pro močovinu. Kromě toho jsou některé akvaporiny propustné pro plyny, například CO2 a NO . Oblast biologie akvaporinů se tedy neustále rozšiřuje a pravidelně se objevují zprávy o nových a nečekaných funkcích v různých buňkách a tkáních.

Aquaporin 1 a 2 (vodní kanál citlivý na VP) v ledvinách

AQP1, vodní kanál červených krvinek, je vysoce exprimován v proximálních tubulech a tenkých sestupných Henleových končetinách, které jsou vždy vysoce propustné pro vodu . Tyto segmenty tubulů se podílejí na reabsorpci 90 % filtrované vody. Druhý akvaporin, AQP2, byl identifikován v hlavních buňkách sběrných kanálků ledvin . Jsou to buňky, které (podobně jako močový měchýř ropušnice) mění svou propustnost pro vodu v reakci na antidiuretický hormon VP, a tím regulují reabsorpci zbývající tekutiny – téměř 20 l denně. AQP2 je vodní kanál regulovaný VP. V přítomnosti VP se AQP2 hromadí na povrchu hlavních buněk a voda prochází epitelem poháněna osmotickým gradientem (obr. 2). Bazolaterální strana těchto tubulů je hypertonická vůči tekutině v lumen tubulů a voda v přítomnosti VP proudí po tomto gradientu dolů. Bazolaterální membrána hlavních buněk je vždy propustná pro vodu díky přítomnosti AQP3 nebo AQP4 v různých částech ledvin . Množství AQP2 v apikální membráně je tedy rychlost limitujícím faktorem, který reguluje reabsorpci vody ve sběrném kanálku ledviny. Mnohaletý výzkum ukázal, že AQP2 recykluje mezi plazmatickou membránou a cytoplazmatickými vezikuly v hlavních buňkách a VP mění rovnováhu tak, že se více AQP2 hromadí na povrchu buňky a méně je ho uvnitř buňky, což odpovídá za zvýšení propustnosti membrány (obr. 2). Buněčná biologie, která je základem tohoto procesu, je částečně objasněna a zahrnuje signální kaskádu, která je zahájena interakcí VP s jeho receptorem, aktivací adenylylcyklázy za účelem zvýšení intracelulárního cAMP, aktivací proteinkinázy A a fosforylací proteinu AQP2. Fosforylace je kritickou událostí, která způsobuje membránovou akumulaci AQP2, a několik laboratoří se podílí na studiích zaměřených na další pochopení tohoto procesu. Zájemce odkazujeme na nedávné podrobné přehledy o tomto procesu .

Patofyziologie akvaporinů

Jak se dalo očekávat, akvaporiny se podílejí na řadě onemocnění, především na ledvinách (obr. 3). Poruchy nebo mutace v AQP2 nebo častěji V2R způsobují nefrogenní diabetes insipidus (NDI), při kterém pacienti nejsou schopni koncentrovat moč a teoreticky by mohli denně vyprázdnit až 18 l zředěné moči, tedy množství, které se normálně reabsorbuje ve sběrném kanálku. Vzhledem k jiným kompenzačním mechanismům produkuje většina pacientů s NDI 5 až 10 l denně . Dostupné léčebné postupy mohou příznaky zmírnit jen částečně a k nalezení lepších léků je zapotřebí další práce. Nejčastější příčinou NDI je u pacientů léčených lithiem pro bipolární poruchu. Lithium způsobuje závažnou downregulaci genu AQP2 z důvodů, které nejsou zcela objasněny . Přestože se jedná o velmi účinnou léčbu bipolární poruchy, kvůli tomuto a dalším nežádoucím účinkům se mnoho pacientů zdráhá zahájit léčbu lithiem. Dalšími poruchami souvisejícími s AQP, většinou identifikovanými na knockoutovaných zvířecích modelech , jsou porucha koncentrace moči (u lidí byl identifikován AQP1), katarakta (AQP0), mozková mrtvice (AQP4) a křehká kůže v důsledku defektní hydratace (AQP3). AQP1 a AQP2 se také podílejí na migraci buněk a hojení ran. A konečně, přitažlivost akvaporinů zaujala reklamní agentury zabývající se například kosmetickým průmyslem. Vygooglujte si to a uvidíte!“

Budoucí směry

Jednou ze zajímavých oblastí biologie akvaporinů je vznik tzv. měsíčních funkcí těchto kanálových proteinů. Ty mohou souviset s jejich kanálovou funkcí, jako v případě plynopropustnosti AQP1, nebo nesouviset s kanálovou aktivitou, jako v případě AQP2, který se podílí na vývoji ledvin prostřednictvím interakce s integriny a extracelulární matrix . Budoucí studie nepochybně odhalí další nečekané vlastnosti akvaporinů. Velké množství akvaporinů se nachází u „nižších“ druhů, které nejsou savci, jako jsou rostliny, mikrobi a houby. To otevírá možnost využít tyto informace ke zlepšení růstu a adaptace rostlin stimulací funkce AQP a k boji proti mikrobiálním a houbovým infekcím inhibicí akvaporinů. Takové specifické inhibitory zatím nejsou k dispozici, ale pokud a až budou vyvinuty, mohly by mít důležitou roli i v medicíně jako akvaretika (k léčbě hypertenze) a možná i u rakoviny (k blokování metastáz). Máme se také co učit o buněčné biologii obchodování s akvaporiny. Jak se pohybují v buňce? Jak interagují s jinými proteiny? Lze identifikovat alternativní signální dráhy a využít je k obejití defektní signalizace V2R u NDI? Tato práce pokračuje a slibuje odhalení buněčných tajemství, která se týkají nejen biologie AQP, ale také dalších důležitých buněčných transakcí, které se podílejí na řadě dalších lidských onemocnění.

Poděkování/prohlášení o zveřejnění informací

D.B. a jeho kolegové z programu MGH pro membránovou biologii získali trvalou podporu pro práci na akvaporinech od National Institutes of Health, v současnosti grant číslo DK096586. D.B. obdržel od společnosti Danone Research úhradu cestovních nákladů a registračního poplatku za účast na vědecké konferenci H4H.

Kontakty na autory

Detaily článku / publikace