Mitochondriální biogeneze a metabolická hyperaktivace omezuje použití MTT testu při odhadu inhibice růstu vyvolané zářením radiací indukované inhibice růstu

Změny v radiací indukované metabolické životaschopnosti nekorelují s inhibicí růstu

Při studiu radiací indukované inhibice růstu u různých buněčných linií pomocí MTT testu a počítání počtu buněk, jsme zjistili, že výsledky získané z testů založených na metabolické životaschopnosti nekorelují se skutečným počtem buněk v různých časových bodech po expozici záření. Vzhledem k tomu, že MTT test je široce používán na základě skutečnosti, že skutečně představuje počet životaschopných buněk v daném vzorku2,3,4 . Zkoumali jsme tento test porovnáním hodnot MTT s počtem buněk. Exponenciálně rostoucí buňky byly vystaveny ionizujícímu záření, aby bylo možné analyzovat inhibici růstu i metabolickou životaschopnost pomocí sčítání počtu buněk a redukce tetrzoliové soli na formazan (klasický MTT test; zde použit jako MTT index), resp. Primárně byly buňky vystaveny různým dávkám ionizujícího záření (2, 3, 5 a 7 Gy), aby bylo možné sledovat změny v závislosti na dávce záření a korelaci mezi počtem buněk a metabolickou životaschopností. Množství vytvořeného formazanu (tj. MTT index) po 48 hodinách po ozáření u všech tří buněčných linií (A549, MDA-MB-231 a HeLa) vykazovalo 20 až 35% snížení (při 5 Gy a 7 Gy; doplňkový obr. 1Ai až Ci) ve srovnání s neozářenými buňkami, zatímco pokles počtu buněk byl v rozmezí 70 až 90 % (doplňkový obr. 1Ai až Ci). 1Aii až Cii), což jasně ukazuje na nedostatek korelace mezi metabolickou životaschopností (MTT index) a inhibicí růstu (počty buněk) při všech dávkách záření; oba analyzované parametry radiační odpovědi.

Dále jsme pro ověření obecnosti tohoto pozorování zkoumali vztah mezi změnami počtu buněk (inhibice růstu) a MTT indexem (metabolická viabilita) u 7 netumorogenních a tumorogenních buněčných linií (NIH/3T3, Raw 264.7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 a MDA-MB-231) při jediné dávce (5 Gy), která vyvolala téměř 50% inhibici růstu u tří testovaných buněk (doplňkový obr. 1). Po 24 hodinách po ozáření vykazovaly všechny hodnocené buněčné linie buď vyrovnání s kontrolou, nebo zvýšení hodnoty MTT indexu (obr. 1Ai až Gi), s výjimkou Raw 264.7 (obr. 1Bi), která je relativně citlivá na záření. Na druhé straně byl za těchto podmínek zaznamenán významný pokles počtu buněk (obr. 1Aii až Gii). Po 48 hodinách od ozáření byl počet buněk výrazně nižší, a to od 43 % (MDA-MB-231, obr. 1Gii) do 76 % (Raw 264.7, obr. 1Bii) ve srovnání s kontrolou, zatímco hodnoty MTT indexu vykazovaly pouze 10%, resp. 37% snížení, s maximem u buněčné linie Raw264.7 (obr. 1Bi). Když byly hodnoty MTT indexu (Δ OD) normalizovány s příslušným počtem buněk, ukázaly 1,4 až 3násobné (u různých buněčných linií) zvýšení metabolické životaschopnosti na buňku (odvozené informace) po 24 a 48 hodinách, které se dále snížilo po 48 hodinách u většiny buněčných linií s výjimkou buněk Raw264.7, NIH/3T3 a HeLa, ale zůstává výrazně vyšší než příslušná kontrola (obr. 1Aiii až Giii). Tato pozorování jasně ukazují, že počet buněk, který je skutečným měřítkem inhibice růstu a/nebo cyto-toxicity vyvolané zářením, nekoreluje s vysoce výkonným testem založeným na metabolické životaschopnosti (MTT), který se široce používá pro rychlé hodnocení odezvy na záření, což je zřejmě způsobeno zvýšenou metabolickou životaschopností vyvolanou zářením (obr. 1). 1Aiii až Giii) exponovaných buněk.

Odhalení zářením zvyšuje metabolickou životaschopnost zvýšením mitochondriální hmoty

Zvýšená metabolická životaschopnost u buněk vystavených záření může být důsledkem buď hyperaktivních mitochondrií, nebo zvýšené mitochondriální hmoty, protože k přeměně MTT na formazan dochází hlavně v mitochondriích7,8,9,10 . Je známo, že ionizující záření indukuje mitochondriální hmotu a funkci v exponovaných buňkách20,21. Proto jsme pomocí průtokové cytometrie zkoumali, zda je zvýšená mitochondriální hmotnost zodpovědná za zvýšený MTT index u buněk vystavených záření. V souladu s dřívějšími pozorováními jsme zjistili, že průměrná hmotnost mitochondrií na buňku byla významně zvýšena téměř 1,4krát u MCF-7 (minimum, obr. 2Fi) až 4krát u Raw 264.7 (maximum, obr. 2Bi) 24 a 48 hodin po expozici záření (obr. 2Ai až Gi). Současně byla v ozářených buňkách v příslušných časových bodech pozorována také zvýšená produkce formazanu na buňku, kvantifikovaná za podobných experimentálních podmínek (obr. 2Aii až Gii). Mikroskopické snímky po 24 hodinách po ozáření rovněž ukazují viditelně zvýšené ukládání formazanu v ozářených buňkách vzhledem k jejich kontrole (obr. 2Aiii až Giii). Tělíska obsahující formazan (mitochondrie) v kontrolních buňkách mají méně intenzivní barvu, jsou řídce a rovnoměrně rozmístěna v cytoplazmě, zatímco v buňkách ozářených zářením měla tmavou barvu a byla seskupena v perinukleární oblasti (obr. 2Aiii až Giii). Tyto mikroskopické snímky poskytují vizuální a podpůrný důkaz vyššího MTT indexu nebo zvýšené metabolické životaschopnosti na buňku u ozářených buněk. Dále potvrzují, jak snížený počet ozářených přežívajících buněk může produkovat mnohem větší množství formazanu (hustota zbarvení) na buňku než příslušné neošetřené kontrolní buňky, což vede k chybné interpretaci dat.

Ozařování zvyšuje metabolickou životaschopnost indukcí mitochondriální biogeneze

Mitochondrie jsou hlavním místem, kde se MTT redukuje na formazan7,8,9,10, proto zvýšení mitochondriální hmoty může zvýšit metabolickou životaschopnost. Zvýšené mitochondriální hmoty v ozářených buňkách by mohlo být dosaženo ze dvou důvodů: za prvé, ionizující záření vyvolává blok G2/M22,23. Buňky zadržené ve fázi G2 budou mít vyšší počet mitochondrií22,23,24, které mohou v ozářených buňkách redukovat více MTT na formazan. Za druhé je známo, že ionizující záření indukuje biogenezi mitochondrií20,21 , což vede ke zvýšení hmotnosti mitochondrií. Abychom otestovali, zda je za zvýšenou hmotnost mitochondrií na buňku v ozářených buňkách zodpovědná zářením indukovaná zástava G2/M nebo mitochondriální biogeneze či obojí, zkoumali jsme obě hypotézy postupně. Vzhledem k tomu, že radiací indukované zvýšení mitochondriální hmoty (obr. 2Ai až Gi) bylo pozorováno u všech buněčných linií, byly pro pochopení mechanismů, které stojí za radiací indukovanou zvýšenou metabolickou životaschopností, náhodně vybrány pouze buňky HeLa a MDA-MB-231.

Rozdělení buněčného cyklu bylo provedeno 24 a 48 hodin po ozáření. Po 24 hodinách bylo u buněk HeLa zjištěno 17 % a u buněk MDA-MB-231 6 % nadbytečné populace buněk v G2/M frakci buněčného cyklu. Tato blokáda se však po 48 hodinách zcela uvolnila (obr. 3A), což naznačuje, že zástava buněčného cyklu vyvolaná radiací může částečně přispívat ke zvýšení mitochondriální hmoty po 24 hodinách, ale nikoli po 48 hodinách. Je také důležité poznamenat, že téměř 17% zvýšení počtu buněk ve fázi G2/M nemůže u buněk HeLa způsobit 1,9násobnou (což je 90 %) změnu mitochondriální hmoty a 1,5násobnou změnu v redukci MTT na formazan po 24 hodinách (obr. 2Di a Dii). Přestože se blok buněčného cyklu po 48 hodinách zcela uvolnil, zůstala mitochondriální hmotnost a zvýšená metabolická životaschopnost výrazně vyšší než u příslušných kontrol. Tato pozorování nepodporují tvrzení, že radiací indukovaná zvýšená metabolická životaschopnost je způsobena zástavou buněčného cyklu zprostředkovanou zvýšenou mitochondriální hmotností, jak bylo dříve uvedeno v případě léčby polyfenolickými sloučeninami18,25.

Pro ověření hypotézy, že radiací indukovaná hypermetabolická aktivita, která koreluje se zvýšenou mitochondriální hmotností v ozářených buňkách (obr. 2Ai až Gi), je způsobena radiací indukovanou mitochondriální biogenezí, jsme dále analyzovali počet kopií mtDNA v kontrolních a ozářených buňkách. Počet kopií genu Leu t-RNA byl měřen pro počet kopií mtDNA kódované mitochondriálním genomem a normalizován s jaderným pol-gamma pomocí semikvantitativní metody PCR. Buňky HeLa i MDA-MB-231 vykazovaly po 24 hodinách expozice záření o 18 % a 31 % vyšší počet kopií mtDNA, který se dále zvyšuje až na 138 % u HeLa a zůstává o 21 % vyšší u MDA-MB-231 než u kontrolních buněk po 48 hodinách (obr. 3B). Dále jsme pomocí Western blotu zkoumali časově závislou hladinu exprese proteinů PGC-1α (koaktivátor 1-alfa peroxisomového proliferátorem aktivovaného receptoru gama) a TFAM (mitochondriální transkripční faktor A). Tyto dva proteiny jsou klíčovým regulátorem biogeneze a údržby mitochondrií v buňkách26,27,28. Je zajímavé, že u buněk (HeLa a MDA-MB-231) vystavených záření bylo pozorováno zvýšení exprese PGC-1α i TFAM v závislosti na čase (obr. 3C), což koreluje se zvýšenou mitochondriální hmotností v časovém bodě 24 hodin (obr. 2Di a Gi). Dále jsme zjišťovali, zda je zvýšená mitochondriální hmota funkční a má zvýšenou expresi proteinu SDH-A, který je primárním redukčním enzymem MTT na formazan7,8,9,10 . Hladina proteinu SDH-A byla rovněž zjištěna zvýšená po 8 a 24 hodinách expozice záření (obr. 3C), což koreluje se zvýšeným MTT indexem nebo zvýšenou metabolickou životaschopností buněk HeLa a MDA-MB-231 (obr. 1 a 2). Hladiny SDH-A byly zjištěny významně zvýšené i u ostatních buněčných linií (údaje nejsou uvedeny). Abychom dále potvrdili hypotézu, že radiací indukovaná mitochondriální biogeneze vede ke zvýšené metabolické životaschopnosti, inhibovali jsme mitochondriální biogenezi pomocí chloramfenikolu29,30 . Zjistili jsme, že chloramfenikol v netoxické koncentraci významně snižuje radiací indukovanou mitochondriální biogenezi, a to u obou buněčných linií (obr. 3D). když jsme u buněk ošetřených chloramfenikolem před expozicí radiaci provedli MTT a růstovou kinetiku (obr. 3E a F), vykazovaly výrazně nižší tvorbu formazanu než samotná radiace (obr. 3E), což naznačuje, že radiací indukovaná zvýšená metabolická viabilita je způsobena především mitochondriální biogenezí. Rozdíl mezi křivkou inhibice růstu vyvolaného zářením získanou z MTT testu a počítáním buněk zůstává u buněk ošetřených chloramfenikolem pouze 8 % (obr. 3E a F), což bylo 25 % a 33 % u buněk HeLa a MDA-MB-231 (obr. 1Di-ii a Gi-ii). Tyto výsledky potvrzují hypotézu, že radiací indukované zvýšení mitochondriální hmoty a metabolické životaschopnosti pochází do značné míry z radiací indukované mitochondriální biogeneze, která je regulována radiací indukovanými PGC-1α a TFAM.

Radiace indukuje hyperaktivaci mitochondrií

V dřívějších výsledcích jsme pozorovali, že ionizující záření indukuje v buňkách mitochondriální hmotu, která je zřejmě zodpovědná za zvýšenou metabolickou životaschopnost (MTT index) u ozářených buněk; je však známo, že radiace také indukuje hyperaktivaci jednotlivých mitochondrií v ozářených buňkách31. Abychom zjistili, zda byl zvýšený MTT index pozorován pouze v důsledku zvýšené mitochondriální hmoty, nebo zda záření vyvolalo také hyperaktivaci mitochondrií, měřili jsme ΔΨm (mitochondriální membránový potenciál, MMP) pomocí fluorescenční mikroskopie s použitím TMRM. Ozářené buňky (po 24 hodinách) vykazovaly jasně červené tečkované mitochondrie svědčící o vysokém ΔΨm ve srovnání s kontrolou (obr. 4A). Tento výsledek byl dále ověřen kvantitativním stanovením ΔΨm pomocí DiOC6 průtokovou cytometrií. Buňky HeLa vykazovaly 2,4 až 2,8násobné zvýšení MMP, avšak buňky MDA-MB-231 vykazovaly 1,3násobné změny radiací indukované MMP v obou časových bodech (obr. 4B). Tento vysoký mitochondriální membránový potenciál koreluje s několikanásobně vyšší tvorbou formazanu v každé mitochondrii ozářených buněk (vložený obrázek na obr. 2Aiii), což naznačuje hyperaktivitu komplexu II (SDH) (obr. 2Aii až Gii), pravděpodobně v důsledku radiací indukovaného zvýšení ΔΨm. Toto pozorování je v souladu s dřívějšími výsledky jiných studií, které naznačují, že komplex II je účinnější při vytváření a udržování ΔΨm za stresových podmínek32,33. Zvýšený ΔΨm v důsledku hyperaktivního komplexu II zajišťuje zvýšenou aktivitu také dalších mitochondriálních dehydrogenáz, které mohou přispívat ke zvýšené tvorbě formazanu jinak než SDH.

Bylo zjištěno, že oxidace řízená sukcinátem prostřednictvím komplexu-II (SDH) významně přispívá ke zvýšené tvorbě mitochondriálních ROS34. Proto jsme analyzovali hladinu mitochondriálního superoxidu v kontrolních a ozářených buňkách, abychom ověřili skutečnost, že hypermetabolicky aktivní mitochondrie by měly produkovat více superoxidových radikálů. Buňky obarvené pomocí MitoSox (indikátor mitochondriálních ROS) byly analyzovány na průtokovém cytometru. Ozářené buňky vykazovaly výrazně zvýšenou fluorescenci MitoSox než jejich příslušná kontrola. Obě buněčné linie vykazovaly téměř 1,25násobné zvýšení mitochondriálních ROS po 24 hodinách, které se však dále zvýšilo na 1,65násobek u buněk HeLa a 1,5násobek u buněk MDA-MB-231 po 48 hodinách po ozáření (obr. 4C). Vzhledem k tomu, že mitochondriální dehydrogenáza SDH je hlavním přispěvatelem k redukci MTT7,8,9,10, potvrzují tyto výsledky pozorování, že zvýšení ROS je přímo úměrné zvýšené aktivitě SDH34. Tyto výsledky naznačují, že zvýšenou mitochondriální hmotu tvoří funkčně hyperaktivní mitochondrie, které v ozářených vzorcích redukují větší množství MTT ve formazanu na buňku.

Ozařování vyvolává akumulaci vápníku v mitochondriích

Ionizující záření narušuje buněčnou homeostázu vápníku, což vede ke zvýšenému uvolňování vápníku z endoplazmatického retikula (ER) do cytoplazmy, který je následně pufrován funkčními mitochondriemi v perinukleární oblasti buněk35,36 . Změněná homeostáza vápníku také indukuje produkci ROS (reaktivních forem kyslíku) a biogenezi mitochondrií35,36,37.

Pro zjištění, zda je zvýšená metabolická životaschopnost pozorovaná po 24 a 48 hodinách způsobena zvýšenou cytoplazmatickou a mitochondriální hladinou Ca2+, byl odhadnut volný buněčný a mitochondriální Ca2+. Kontrolní a ošetřené buňky byly v příslušných časových bodech obarveny pomocí Fluo-3AM (indikátor Ca2+) a Rhod-2AM (specifický mitochondriální indikátor Ca2+)38 a analyzovány na průtokovém cytometru. U ozářených buněk bylo pozorováno výrazné zvýšení hladiny vápníku, která se u obou zkoumaných buněčných linií (HeLa a MDA-MB-231) zvýšila téměř 1,4krát (40 %), jak naznačuje zvýšená fluorescence Fluo-3 po 8 hodinách, která se po 24 hodinách mírně snižuje (obr. 5A). Zajímavé je, že bylo zaznamenáno ještě větší radiací indukované zvýšení mitochondriálního Ca2+ (2,4násobné u HeLa a 1,6násobné u MDA-MB-231, obr. 5B). Toto pozorování bylo dále ověřeno vizualizací obarvených buněk pod fluorescenčním mikroskopem. Byly pozorovány buňky obarvené nezávisle na sobě barvivy Mitotracker Red, Fluo-3AM a Rhod-2AM po 24 hodinách po ozařování. Fluo-3AM i Rhod-2AM vykazují silnou perinukleární bodovou fluorescenci se stejným obrazcem, jaký vykazuje mitotrackerová červeň v odpovídajících buňkách vystavených radiaci (obr. 5C), což naznačuje, že v mitochondriích se hromadí zvýšený cytoplazmatický Ca2+. Navíc specifické signály Ca2+ z mitochondrií v buňkách obarvených Rhod-2AM toto pozorování potvrzují. Je zajímavé, že buňky MDA-MB-231 vykazovaly již v kontrolních buňkách vysoké mitochondriální Ca2+ (barvení Rhod-2AM) a perinukleární mitochondriální shluky (barvení Mitotracker Red), které se po ozáření dále zvyšují, to by mohl být důvod, proč tato buňka následně vykazovala nejnižší nárůst radiací indukované mitochondriální biogeneze a tvorby formazanu. V naší dřívější studii jsme prokázali, že záření způsobuje akumulaci Ca2+ v mitochondriích, což vede k poškození mitochondrií a mitofagii36. Mitochondrie s vysokým obsahem Ca2+ a zvýšeným mitochondriálním membránovým potenciálem akumulují více A23187 a při UV excitaci vykazují pod mikroskopem jasnější fluorescenci. Trvale poškozené mitochondrie však vykazují velmi vysokou fluorescenci a jeví se jako kulatá tělíska uvnitř buňky36. Abychom mohli pozorovat akumulaci Ca2+ v mitochondriích za těchto experimentálních podmínek, obarvili jsme kontrolní a ozářené buňky HeLa a MDA-MB-231 po 24 hodinách od expozice (obr. 5C). Ozářené buňky rovněž vykazovaly vyšší akumulaci tělísek svědčící o radiací indukovaném poškození mitochondrií. Ozářené buňky vykazují vyšší fluorescenci Mitotracker Red, Fluo-3AM a Rhod-2AM v perinukleární oblasti (obr. 5C), kde mitochondrie tvoří síť s endoplazmatickým retikulem (ER) a akumulují většinu stresem indukovaného úniku Ca2+ z ER a chrání buňky před smrtí39. Toto zjištění naznačuje, že Ca2+ uvolněný ze zásob po expozici záření se hromadí hlavně v mitochondriích. Již dříve se uvádělo, že vysoký obsah Ca2+ v mitochondriální matrix zvyšuje aktivitu SDH40. Proto korelujeme, že Ca2+ nahromaděný v mitochondriích zvyšuje aktivitu komplexu SDH, což vede k hyperaktivním mitochondriím a zvýšené metabolické životaschopnosti u buněk vystavených radiaci.

Hromadění vápníku v mitochondriích vede k hyperaktivnímu metabolickému stavu buněk

Dále jsme pro doložení role Ca2+ ve zvýšené tvorbě formazanu testovali, zda samotné narušení Ca2+ v buňkách může zvýšit metabolickou životaschopnost. K ověření této teze byly buňky ošetřeny Ca2+ ionoforem A23187 (2 µM, který zvyšuje cytoplazmatický Ca2+, stejně jako ionizující záření) po dobu 1 hodiny a analyzována metabolická životaschopnost po 4, 8 a 24 hodinách po ošetření. Je zajímavé, že buňky ošetřené A23187 vykazovaly významně zvýšenou (1,6násobnou) metabolickou viabilitu na buňku po 8 & 24 hodinách u HeLa a po 4 & 8 hodinách u MDA-MB-231 (obr. 6A), po ošetření. Tyto výsledky naznačují, že zvýšený cytoplazmatický Ca2+ zvyšuje metabolickou životaschopnost tím, že zvyšuje akumulaci Ca2+ v mitochondriích (obr. 5C). Ověřili jsme také, zda inhibice akumulace Ca2+ v mitochondriích může zbrzdit radiací indukované zvýšení mitochondriální hmoty. Zajímavé je, že jsme zjistili, že buňky ošetřené inhibitorem mitochondriálního Ca2+ uniportéru, rutheniovou červení (RuR, která inhibuje akumulaci Ca2+ v mitochondriích), vykazovaly výrazně nízký nárůst mitochondriálního obsahu (indukovaný zářením) ve srovnání se samotným zářením (obr. 6B). Je známo, že zvýšené množství Ca2+ indukuje biogenezi mitochondrií prostřednictvím CaMKII (Calmodulin Kinase-II)37,41, což je také mitochondriální rezidentní protein, o kterém je známo, že reguluje expresi PGC-1α37,41,42 . Proto jsme dospěli k závěru, že inhibice akumulace Ca2+ v mitochondriích pomocí rutheniové červeně snížila hmotnost mitochondrií, pravděpodobně inhibicí mitochondriální biogeneze. Abychom dále ověřili, zda zářením indukované zvýšení cytoplazmatického Ca2+ a jeho akumulace v mitochondriích vede ke zvýšení metabolické životaschopnosti ozářených buněk, ošetřili jsme buňky 30 minut před ozářením BAPTA-AM (intracelulární chelátor vápníku) a RuR. Jak chelatace zvýšeného cytoplazmatického Ca2+ pomocí BAPTA-AM (obr. 6C), tak inhibice akumulace Ca2+ v mitochondriích pomocí RuR (obr. 6D) zrušily radiací indukovanou zvýšenou metabolickou životaschopnost po 24 a 48 hodinách ozařování u buněk HeLa a MDA-MB-231 (obr. 6C a D). Tyto výsledky naznačují, že radiací vyvolaná porucha homeostázy Ca2+ hraje také důležitou roli v hyperaktivaci mitochondrií a zvýšené metabolické životaschopnosti, pravděpodobně předcházející mitochondriální biogenezi.

.