Van ‚t Hoff získal své první renomé v oblasti organické chemie. V roce 1874 vysvětlil jev optické aktivity předpokladem, že chemické vazby mezi atomy uhlíku a jejich sousedy směřují do rohů pravidelného čtyřstěnu. Tato trojrozměrná struktura vysvětlovala izomery vyskytující se v přírodě. O tuto teorii se dělí s francouzským chemikem Josephem Le Bellem, který nezávisle na něm přišel se stejnou myšlenkou.
Tři měsíce před udělením doktorského titulu Van ‚t Hoff tuto teorii, která je dnes považována za základ stereochemie, publikoval nejprve na podzim roku 1874 v nizozemském letáku a poté v květnu následujícího roku v malé francouzské knize s názvem La chimie dans l’espace. Německý překlad vyšel v roce 1877, v době, kdy jediné zaměstnání, které Van ‚t Hoff mohl najít, bylo na veterinární škole v Utrechtu. V těchto prvních letech byla jeho teorie vědeckou komunitou do značné míry ignorována a ostře ji kritizoval jeden z významných chemiků, Hermann Kolbe. Kolbe napsal:
„Dr. J. H. van ‚t Hoff z veterinární školy v Utrechtu zřejmě nemá v oblibě exaktní chemické zkoumání. Považoval za pohodlnější nasednout na Pegase (zřejmě vypůjčeného z Veterinární školy) a ve své knize „La chimie dans l’espace“ hlásat, jak se mu při jeho odvážném letu na vrchol chemického Parnasu zdálo, že atomy jsou uspořádány v kosmickém prostoru.“
Kolem roku 1880 však podpora Van ‚t Hoffovy teorie ze strany takových významných chemiků, jako byli Johannes Wislicenus a Viktor Meyer, přinesla uznání.
V roce 1884 publikoval Van ‚t Hoff svůj výzkum chemické kinetiky pod názvem Études de Dynamique chimique („Studie z chemické dynamiky“), v němž popsal novou metodu určování řádu reakce pomocí grafiky a aplikoval zákony termodynamiky na chemické rovnováhy. Zavedl také moderní pojem chemické afinity. V roce 1886 ukázal podobnost mezi chováním zředěných roztoků a plynů. V roce 1887 založil spolu s německým chemikem Wilhelmem Ostwaldem vlivný vědecký časopis Zeitschrift für physikalische Chemie („Časopis pro fyzikální chemii“). Pracoval na teorii disociace elektrolytů Svanteho Arrhenia a v roce 1889 poskytl fyzikální zdůvodnění Arrheniovy rovnice. V roce 1896 se stal profesorem Pruské akademie věd v Berlíně. Jeho studie ložisek soli ve Stassfurtu byly významným přínosem pro pruský chemický průmysl.
Van ‚t Hoff se stal lektorem chemie a fyziky na Vysoké škole veterinární v Utrechtu. Poté působil téměř 18 let jako profesor chemie, mineralogie a geologie na univerzitě v Amsterdamu a nakonec se stal vedoucím katedry chemie. V roce 1896 se Van ‚t Hoff přestěhoval do Německa, kde v roce 1911 ukončil svou kariéru na univerzitě v Berlíně. V roce 1901 obdržel první Nobelovu cenu za chemii za práci s roztoky. Jeho práce ukázala, že velmi zředěné roztoky se řídí matematickými zákony, které se velmi podobají zákonům popisujícím chování plynů.