Immunohistochemie (IHC) je výkonná mikroskopická technika pro vizualizaci buněčných složek, například proteinů nebo jiných makromolekul ve vzorcích tkání. Silnou stránkou IHC je intuitivní vizuální výstup, který odhaluje existenci a lokalizaci cílového proteinu v kontextu různých buněčných typů, biologických stavů a/nebo subcelulární lokalizace v rámci komplexních tkání.
Technika IHC byla vynalezena během 40. let 20. století (Coons, Creech, & Jones, 1941) a běžně se používá jako důležitý nástroj ve zdravotnictví a patologii např. pro diagnostické účely nebo pro stratifikaci pacientů pro optimalizované léčebné režimy. IHC se také široce používá ve výzkumu, kde se analyzují zájmové molekuly za účelem studia jejich role ve zdravých i nemocných buňkách a tkáních na molekulární, buněčné nebo tkáňové úrovni. Existuje mnoho různých způsobů, jak provádět vizualizaci cílů v tkáních pomocí IHC nebo metod založených na IHC, a existuje mnoho protokolů pro různé aplikace a testy. Přestože IHC je obecně robustní a zavedená metoda, nové testy často vyžadují pečlivou optimalizaci v závislosti na tkáni nebo na vlastnostech cílového proteinu, pojiva-molekuly a/nebo reportérového systému. Mnoho let technického vývoje a obrovský nárůst dostupnosti specifických vazebných molekul výrazně zlepšily užitečnost a oblasti použití IHC. Pokrok v oblasti technik a činidel založených na IHC umožnil vědcům a poskytovatelům zdravotní péče přesnější nástroje, testy a biomarkery. Kromě toho technický pokrok umožnil např. vysoce citlivou současnou detekci více proteinů ve stejném vzorku a detekci interakcí protein-protein (viz Proximity Ligation Assay).
Klasický test IHC je znázorněn na obrázku 1 a zahrnuje detekci epitopů exprimovaných jedním proteinem-cílem ve vzorku tkáně pomocí „primární protilátky“ schopné vázat tyto epitopy s vysokou specifitou. Po navázání epitopu na protilátku se přidá „sekundární protilátka“ schopná vázat primární protilátku s vysokou specifitou. Sekundární protilátka je spojena s reportérovou molekulou a po vazbě protilátka-protilátka se přidá chemický substrát, který reaguje s reportérovou molekulou za vzniku barevné sraženiny v místě celého komplexu epitop-protilátka.
Obrázek 1. Základní princip imunohistochemie.
Na schematickém obrázku (Obrázek 1) je formalínem fixovaný, do parafínu zalitý řez tkání obarven pomocí primární protilátky namířené na specifický proteinový cíl. Roztok obsahující primární protilátku se přidá do tkáňového řezu a protilátkám se ponechá určitý čas, aby našly a navázaly se na svůj cíl. Po tomto kroku se nenavázané a přebytečné protilátky smyjí a přidá se sekundární protilátka. Sekundární protilátka, která nese spojovací molekulu s enzymy křenové peroxidázy (HRP), se rovněž nechá nějaký čas navázat na primární protilátku, po čemž následuje další promývací krok. Poté se přidá 3,3′ diaminobenzidin (DAB). Enzym HRP přemění substrát DAB na hnědavou sraženinu, která se uloží ve tkáni v místě reakce, čímž vznikne vizuální zobrazení místa, kde se primární protilátka poprvé navázala na svůj cíl.
Technologie
Příprava tkáně
Tkáň hraje v experimentu hlavní roli a je důležité, aby byla zpracována tak, aby byly zachovány epitopy a správná morfologie. Nejběžnějším zpracováním pro IHC je příprava tkáňových bloků fixovaných formalínem a zalitých do parafínu (FFPE). Účelem fixace formalínem je vytvořit chemické zesíťování proteinů ve tkáni. Tím se ukončí všechny buněčné procesy a zmrazí se buněčné složky na místě a v konformaci, ve které byly v době fixace, a také se zabrání jejich degradaci. Po dostatečné fixaci se tkáň dále zpracovává a nakonec se vloží do parafinových bloků, které se pak pomocí mikrotomu rozřežou na tenké řezy (obvykle 4-10 µm). Řezy se přenesou na skleněná sklíčka a před dalším zpracováním se nechají přilnout.
Někdy se kromě formalínu používají i jiné metody fixace. Patří mezi ně jiné typy aldehydů nebo použití různých alkoholových roztoků. Nejlepší volba fixačního prostředku do značné míry závisí na analýze. Běžnou alternativou k FFPE je příprava zmrazených vzorků tkání. V tomto případě se tkáň vloží do kryoprotektivního média a zmrazí a fixace se provede až po řezu. Zmrazené tkáně se řežou v kryostatech a jejich výhodou je krátká doba zpracování a lepší zachování citlivých epitopů, ale často mohou být horší než tkáně FFPE, pokud jde o zachování histologické morfologie.
Získávání antigenů (epitopů)
Obavou spojenou se síťujícími fixačními prostředky, jako je formalín, nebo příliš dlouhou dobou strávenou ve fixačním médiu je maskování epitopů, které mohou bránit primární protilátce ve vazbě na její cíl. Zejména u vzorků FFPE je často potřeba vrátit část chemického zesíťování a „získat“ epitopy předtím, než se přistoupí k vlastní IHC. K dispozici je několik protokolů pro získání antigenu a mezi hlavní strategie patří ošetření tkáňového preparátu teplem, trávicími enzymy, detergenty nebo jejich kombinací. Nejběžnější metodou získávání antigenů u vzorků FFPE je tlakové vaření tkáňových preparátů v kyselém citrátovém pufru po dobu přibližně 15-20 minut.
Vazba protilátek
Kvalita a specifičnost vazebné molekuly je pro každou techniku založenou na IHC klíčová a volba pojiva může přímo ovlivnit výsledek, spolehlivost a případně také interpretaci testu. Protilátky jsou zdaleka nejběžnějším typem vazebné molekuly používané pro IHC, a přestože většina protilátek je schopna adekvátně detekovat správnou molekulu zájmu, mohou se také značně lišit ve své specifičnosti pro zamýšlený cíl. Protilátky s vysokou specifitou jsou proto spolehlivější při interpretaci vazby „na cíl“, protože vytvářejí jen malou nebo žádnou vazbu „mimo cíl“ nebo „pozadí“. Protilátky, které jsou méně specifické, mohou vytvářet více vazeb mimo cíl a výsledné pozadí může narušit správnou interpretaci skutečných signálů „on-target“. Existují dva hlavní typy protilátek: polyklonální protilátky, což je heterogenní směs protilátek, které vážou různé epitopy na cíli, a monoklonální protilátky, které vážou stejný epitop. Polyklonální protilátky jsou často velmi účinné díky své schopnosti detekovat a vázat více epitopů na stejném cíli. Epitopy, které vážou, jsou však často špatně definované a s vícenásobnou a různou specifitou epitopů se zvyšuje pravděpodobnost vazeb mimo cíl a šumu na pozadí. Účinnost polyklonálních protilátek však může být výhodná, protože koncentrace vazebných událostí kolem cílové molekuly obvykle převáží potenciální šum pozadí. Nevýhodou je, že polyklonální protilátky mají obvykle omezené zdroje, protože se získávají ze zvířecích sér. Naproti tomu monoklonální protilátky mají větší kontinuitu, protože je lze vyrábět v hybridomových buněčných liniích. Monoklonální protilátky jsou také často dobře definovány z hlediska vazby na epitop, ale přesto mohou generovat výsledky, které je obtížné interpretovat, pokud je specifita nízká nebo pokud je cílový epitop přítomen v malém množství.
Pro každý test je nutná pečlivá optimalizace a titrace koncentrace protilátky, protože výsledek závisí nejen na specifitě a afinitě protilátky k cíli, ale také na koncentraci a dostupnosti on-target a potenciálních off-target epitopů přítomných ve vzorku. Přidání příliš velkého množství protilátek do vzorku zvýší počet možných vazebných událostí s nízkou afinitou mimo cíl, jakmile se on-target epitop(y) nasytí vazebnými látkami. Snížením koncentrace protilátek se mimocílové vazebné události stanou vzácnějšími, protože mají obvykle nižší afinitu než on-target vazebné události. Riziko při pokusu o snížení pozadí při použití protilátky s nízkou afinitou spočívá v tom, že signály na cíli jsou současně oslabeny do té míry, že poskytují falešně negativní výsledek.
Mezi další typy vazebných molekul, které se někdy používají v technikách založených na IHC, patří afinity, peptidy, fragmenty protilátek nebo jiné malé molekuly.
Detekční systémy
Celým účelem provádění IHC je získat vizuální zobrazení toho, kde se cíl nachází v experimentální tkáni, a pokud možno také získat informace o vzorci exprese cíle mezi heterogenními buněčnými populacemi a/nebo subcelulárními lokalizacemi. To je ilustrováno na obrázku 2, který ukazuje, jak se různé protilátky používají k vizualizaci různých buněčných nebo tkáňových kompartmentů v rámci komplexní tkáně. K vizualizaci interakce mezi cílem a protilátkou je zapotřebí nějaký detekční systém, který vytváří pozorovatelnou skvrnu nebo signál. Nejběžnější metodou zavedení detekčního systému do experimentu je použití sekundární protilátky, která nese předem navázanou reportérovou molekulu, tj. enzym nebo fluorofor. Sekundární protilátky jsou obvykle specificky zaměřeny na molekuly protilátek jiného živočišného druhu. Například pokud je primární protilátka chována u králíka, pak musí být sekundární protilátka chována u jiného zvířete a zaměřena specificky na králičí protilátky.
| Jícen | Zvětšení | |||
|---|---|---|---|---|
| Barvení hematoxylinem | Barvení bez protilátek | |||
| TP63 CAB000083 |
Barvení na jádro | |||
| . EGFR CAB000035 |
Membránové barvení | |||
| G6PD HPA000247 |
Barvení cytoplazmy | |||
| LAMB2 (Laminin) CAB000053 |
Pojivová tkáň |
Obrázek 2. Vizualizace různých proteinových cílů v komplexních tkáních. V pravém sloupci je uvedeno zvětšení odpovídajících snímků v levém sloupci.
Na snímku IHC (obr. 2) umožňují po sobě jdoucí řezy lidským jícnem obarvené pomocí čtyř různých protilátek přímé srovnání různých vzorců exprese proteinů v rámci tkáně a v rámci subcelulárních kompartmentů. Na horních snímcích je pro srovnání použito pouze protibarvení hematoxylinem. Protilátka p63 barví buněčná jádra v populaci buněk, které se nacházejí v bazální části epitelu jícnu. Zdá se, že protilátka proti EGFR (receptor pro epidermální růstový faktor) barví stejnou populaci buněk jako p63, ale místo jader barví buněčné membrány. Protilátka proti G6PD (glukózo-6-fosfátdehydrogenáza) barví cytoplazmu širšího repertoáru buněk jícnového epitelu a také buněk nacházejících se v pojivové tkáni. Protilátka proti lamininu (LAMB2) barví pouze buňky a struktury v pojivové tkáni pod jícnem.
U vzorků tkáně FFPE je nejběžnější metodou detekce použití enzymatických reakcí k vytvoření barevného precipitátu v místě vazby protilátky. Sekundární protilátky pak nesou enzym, např. křenovou peroxidázu (HRP) nebo alkalickou fosfatázu (AP), které jsou schopny přeměnit chromogeny, jako je 3,3′ diaminobenzidin (DAB) nebo 5-bromo-4-chlor-3-indolylfosfát/p-nitroblue tetrazoliumchlorid (BCIP/NBT), na hnědé nebo namodralé precipitáty, které se ukládají ve tkáni v místě reakce. Chromogenní barviva jsou pozorovatelná ve světelné mikroskopii a jsou obvykle velmi stabilní po dlouhou dobu, což je výhodné, pokud je třeba experiment archivovat nebo později přezkoumat.
Pro zmrazené tkáňové řezy se častěji používají sekundární protilátky vázané na fluorofory, které po excitaci správnou vlnovou délkou světla emitují specifickou barvu (obvykle zelenou, červenou nebo modrou). Fluorofory navíc obvykle nejsou dlouhodobě stabilní. Výhodou použití fluoroforů je však to, že poskytují snadnou metodu pro provádění experimentů s dvojitým značením, kdy se ve stejném vzorku testuje několik protilátek proti více cílům. Sekundární protilátky musí být zaměřeny proti různým primárním protilátkám a také musí být spojeny s různými fluorofory. Různé sekundární protilátky se pak pozorují odděleně tím, že se postupně excitují různými vlnovými délkami světla. Tyto různé výsledky excitace jsou uloženy jako samostatné obrazy (nebo barevné kanály) a mohou být později překryty, aby bylo možné odvodit kolokace proteinů atd.
Použití sekundárních protilátek nesoucích reportér pro detekci je samo o sobě krokem zesílení, protože několik sekundárních protilátek je schopno vázat jednu primární protilátku, ale někdy jsou žádoucí další kroky zesílení, aby se zvýšil signál a citlivost experimentu. V takových případech může sekundární protilátka namísto toho nést „spojovací molekuly“, například biotinové polymery, které jsou schopny v následujících krocích rekrutovat větší počet reportérových molekul. Tato strategie zesílení signálů je užitečná jak pro enzymatické, tak pro fluorescenční metody detekce.
Kontrastní barvení
Imnohistochemické barvení pomocí chromogenů často těží z toho, že je použito kontrasvětlo, které zvyšuje kontrast a usnadňuje pozorování histologických rysů. Nejběžnějším typem protibarviva používaného u vzorků FFPE je hematoxylin, který obarví buněčnou cytoplazmu světle namodralou barvou a buněčná jádra obarví tmavším namodralým odstínem. Fluorescenční barvení se obvykle hematoxylinem nebarví, protože metoda detekce není založena na světelné mikroskopii. Místo toho je nejběžnějším způsobem, jak získat protibarvení pro fluorescenci, označení buněčných jader přidáním fluorescenčních barviv, která vážou nukleové kyseliny. Po vlastní imunohistochemické reakci zbývá pouze přikrýt a uzavřít vzorek pro ochranu a dlouhodobé skladování. Nejběžnějším způsobem je „přilepení“ krycího sklíčka ke vzorku pomocí komerčně dostupných účelových pryskyřic.
Konkrétní příklady
IHC se široce používá ve výzkumu i v klinické praxi. Projekt Human Protein Atlas (HPA) je ukázkovým příkladem využití vysoce výkonné IHC k rozsáhlému mapování lidského proteomu v mnoha tkáních, nádorových onemocněních a buňkách. V projektu HPA usnadňuje zjednodušený vlastní řetězec výroby protilátek ve velkém měřítku generování specifických protilátek, které se po absolvování základních charakterizačních a validačních režimů používají k systematickému barvení tkáňových mikročipů obsahujících stovky tkáňových jader v rámci jednoho experimentu. Systém pro IHC používaný společností HPA se do značné míry spoléhá na standardizaci protokolů a automatizaci pomocí strojů, ale vyhodnocení optimální titrace pro každou protilátku se provádí ručně předtím, než je protilátka schválena pro barvení na celé sadě tkání. Každé obarvené tkáňové jádro je opatřeno anotací s ohledem na imunohistochemické barvení v tkáních a buněčných typech a poté je zveřejněno jako obrázek ve vysokém rozlišení na webovém portálu, který si může kdokoli volně prohlédnout.
V klinické praxi se IHC používá především v rámci patologie, aby lékařům pomohla vyhodnotit vzorky tkání s ohledem na zdravý a nebo nemocný stav, stanovit diagnózu a definovat molekulární podtyp různých typů rakoviny. Konkrétním příkladem, kdy se IHC používá v diagnostice, je situace, kdy je patologům předložen vzorek metastatického nádoru a původ tkáně primárního nádoru není znám. V těchto případech patologové používají panel různých protilátek, které cílí na tkáňově specifické proteiny, jako je prostatický specifický antigen u karcinomu prostaty nebo estrogenový receptor u gynekologických nádorů nebo cytokeratin 20 u nádorů trávicího traktu (Gremel et al., 2014). Jakmile je provedena široká klasifikace, použijí se další tkáňově specifické protilátky k dalšímu určení původu primárního nádoru. Tyto informace jsou užitečné pro volbu nejlepší nebo nejvhodnější strategie farmakoterapie a/nebo pro lokalizaci primárního nádoru pro radioterapii a/nebo chirurgický zákrok.
Odkazy a reference
Běžně používané protilátky pro diagnostiku rakoviny:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopatologie. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
Přehled validace protilátek pro IHC:
O’Hurley G et al, Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – otevřená databáze veřejně dostupných protilátek a jejich užitečnosti v různých aplikacích:
Svět IHC – protokoly, fórum, produkty a další:
Klip na YouTube ilustrující IHC od BioGenexLaboratories:
.