Immunoanalytický screening difenhydraminu (Benadryl®) v moči a krvi Using Newly Developed Assay

Chemické struktury antihistaminik.

Tradiční metody testování DPH v lidské plazmě zahrnovaly nákladnou a časově náročnou extrakci vzorku a následné konfirmační postupy. Několik skupin uvedlo použití různých metod plynové chromatografie (GC) pro detekci DPH v plazmě a moči (23-27). Existují také zprávy o metodách kapilární elektroforézy (28) a kapalinové chromatografie s hmotnostním spektrometrem (LC-MS) (29), které byly vyvinuty pro detekci DPH. Dosud se v literatuře neobjevily žádné zprávy o screeningu difenhydraminu pomocí ELISA nebo jiné imunoanalytické metody. V této publikaci uvádíme první screeningovou metodu ELISA na přítomnost DPH v lidské moči a krvi.

V toxikologických laboratořích se považuje za standardní postup provádění imunochemického screeningu, při němž jsou pozitivní vzorky nejprve identifikovány a dále potvrzeny technikami GC-MS nebo LC-MS. Tento postup používá většina toxikologických laboratoří jako strategii „poměru nákladů a přínosů“, na rozdíl od provádění nákladnějšího konfirmačního postupu u každého přijatého vzorku. Proto by byla užitečná spolehlivá screeningová metoda ELISA pro použití na vzorky DPH týkající se dopravních nehod a smrtelných nehod. Za tímto účelem předložili toxikologové doporučení pro DUID, včetně navrhované hraniční hodnoty DPH 25 ng/ml v krvi a 50 ng/ml v moči (30). Tento článek popisuje robustní a přesnou metodu ELISA pro screening DPH v lidské moči a krvi podle těchto navržených doporučení.

Experimentální

Materiály

Reagencie a chemikálie. Difenhydramin byl získán od společnosti Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI) a difenhydramin-d3 (100 μg/ml roztok v methanolu) byl získán od společnosti Cerilliant (Round Rock, TX). Polyklonální specifickou protilátku vůči DPH vypěstovala společnost Immunalysis (Pomona, CA) a konjugáty značené haptenem DPH a křenovou peroxidázou byly syntetizovány ve společnosti Immunalysis. Substrátové činidlo 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB) použité pro kolorimetrickou reakci bylo získáno od společnosti Pierce (Rockford, IL). Enzymy použité v procesu byly hovězí tyreoglobulin (BTG) získaný od firmy Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), křenová peroxidáza (HRP) získaná od firmy BBI Enzymes (Madison, WI) a hovězí sérový albumin (BSA) získaný od firmy Proliant Biologicals (Boone, IA). Všechna použitá rozpouštědla byla třídy HPLC a všechny chemikálie byly třídy ACS a byly získány od společnosti Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Pro ELISA byly vysoké kalibrátory pro DPH v koncentraci 1000 ng/ml připraveny v syntetické negativní moči a syntetické negativní krvi a skladovány při 4 °C. Syntetická negativní moč a syntetická negativní krev použité v tomto testu byly připraveny ze složek, které se nacházejí v těchto příslušných matricích, a odpovídaly imunoanalytickým reakcím tří negativních vzorků lidské moči a krve (31, 32). Syntetická negativní moč se skládá z 0,1% roztoku BSA v deionizované vodě; s 0,2% žlutým barvivem FD&C č. 6 a syntetická negativní krev se skládá z patentovaného přípravku Immunalysis.

Přístroj. Afinitní kolony HiTrap protein G HP, které byly použity pro purifikaci imunoglobulinu G (IgG), byly zakoupeny od společnosti GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Standardní polystyrenové mikrotitrační destičky (96 jamek) byly získány od společnosti Corning Costar (Corning, NY). Myčka mikrotitračních destiček Tecan Columbus Pro a čtečka destiček Tecan Sunrise byly získány od společnosti Tecan (San Jose, CA). Pipety, které byly použity při vývoji imunoanalýzy, byly všechny získány od společnosti Rainin Instruments (Oakland, CA). Trojitý kvadrupólový MS 6410 a kolona Zorbax Eclipse XDB C18 použitá pro analýzu LC-MS-MS byly zakoupeny od společnosti Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Metody

ELISA. Primárním krokem při vývoji metody ELISA bylo vytvoření polyklonálních protilátek, které byly založeny na imunochemické reakci vybraného živočišného druhu na specifický antigen DPH. Za tímto účelem byli králíci nejprve imunizováni antigenem DPH sestávajícím z DPH konjugovaného s hovězím tyreoglobulinem (BTG). Proces imunizace a vykrvení králíků byl zadán specializovanému zvířecímu zařízení. Sérum získané od králíků bylo přečištěno ve vlastní laboratoři pomocí afinitní chromatografie elucí přes kolonky s proteinem G, aby se získala přečištěná frakce IgG. DPH specifický polyklonální IgG byl poté imobilizován na 96jamkové polystyrenové mikrotitrační destičky. Přebytečná protilátka byla odsáta, volná vazebná místa protilátky byla zablokována 1% roztokem trehalózy ve vodě a destičky byly poté sušeny ve vakuové sušárně při 37 °C přes noc. Destičky byly dále skladovány v zapečetěném sáčku s vysoušedlem, protože je velmi důležité udržet je bez vlhkosti. Křivka závislosti dávky DPH na moči byla nejprve připravena obohacením negativní syntetické moči o 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 a 500 ng/ml z vysokého zásobního roztoku kalibrátoru léčiva. Křivka pro krev byla získána obohacením negativní syntetické krve o 1, 5, 10, 25, 50, 100 a 250 ng/ml z roztoku vysokého kalibrátoru. Tyto kalibrátory v syntetické krvi byly poté před analýzou dále ředěny v poměru 1:10 100 mM fosfátovým pufrem obsahujícím 150 mM chloridu sodného (fosfátový pufr, pH 7,0). Všechny vzorky krve byly podobně zředěny v poměru 1:10 fosfátovým pufrem (pH 7,0). Vzorky moči byly rovněž ředěny v poměru 1:20 100 mM fosfátovým pufrem (pH 7,0). Kalibrátory a vzorky byly poté dvakrát pipetovány do jamek mikrotitrační destičky s použitím 10 μl vzorku jak pro moč, tak pro krev. Následovalo přidání 100 μl enzymového konjugátu sestávajícího z difenhydraminu značeného HRP. Destička se poté nechala inkubovat 1 hodinu ve tmě při pokojové teplotě. Jamky byly poté šestkrát promyty 350 μl deionizované vody pomocí myčky mikrotitračních destiček, odsáty, aby se odstranila voda, a poté obráceny a osušeny, aby se z jamek odstranila zbytková voda. Poté byl do každé jamky přidán chromogenní substrát TMB (100 μl) a destička byla inkubována dalších 30 minut ve tmě. Reakce byla poté zastavena 100 μl 1 N kyseliny chlorovodíkové, aby se vytvořilo žluté zbarvení. Test je kolorimetrický a absorbance byla odečtena při dvojí vlnové délce 450 nm a 650 nm pomocí čtečky mikrotitračních destiček. Při vlnové délce 650 nm se měří absorbance pozadí, kterou pak čtečka odečte od konečné absorbance. Intenzita vzniklé barvy je nepřímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku.

LC-MS-MS. K analýze byla použita LC pumpa řady 1200 spojená s trojnásobným kvadrupólovým MS 6410 pracujícím v režimu pozitivní elektrosprejové ionizace (ESI). Použitá kolona LC-MS-MS byla Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). Vzorek pro analýzu byl připraven následujícím způsobem: do autosamplerové lahvičky bylo přidáno 100 µl vzorku moči obsahujícího 50 µl difenhydraminu-d3 (200 ng/ml). Vzorky byly vstříknuty přímo do LC-MS-MS pomocí autoinjektoru. Teplota kolony byla udržována na 60 °C a injekční objem byl 5 µl. Mobilní fáze se skládala z 0,2% kyseliny octové pH 4 (rozpouštědlo A) a methanolu (rozpouštědlo B). Zpočátku bylo složení mobilní fáze 100 % A při průtoku 0,7 ml/min po dobu 6 min, poté byl podíl methanolu zvýšen na 100 % a po 7 min se opět vrátil na 100 % A.

Teplota plynu byla 350 °C, průtok plynu byl 10 l/min a tlak v nebulizátoru byl udržován na 50 psi. Jako kolizní plyn byl použit dusík a kapilární napětí bylo 4000 V. Pro každé léčivo byly vybrány a optimalizovány dva přechody. Doba zdržení byla 50 ms a optimální energie fragmentoru byla 80 V pro všechny přechody. Optimální kolizní energie byly stanoveny na 35 V pro deuterovaný vnitřní standard (difenhydramin-d3), 15 V pro primární přechod a 30 V pro sekundární přechod pro samotný difenhydramin. Poměr kvalifikačního a kvantifikačního přechodu byl stanoven přibližně uprostřed kalibračního rozsahu: 100 ng/ml. Přechod pro difenhydramin-d3 byl 259,7 > 165,2; primární (kvantifikační) přechod pro difenhydramin byl 256,7 > 167,2; kvalifikační (sekundární) přechod 256,7 > 152,2. Neznačený difenhydramin se může z prekurzorového iontu rozpadat na produktové ionty o m/z 167 nebo 165 v závislosti na použité energii srážky. Náš postup byl ověřen za popsaných podmínek. Mez detekce (LOD) metody LC-MS-MS byla 10 ng/ml a byla stanovena jako nejnižší detekovatelná koncentrace s poměrem signál/šum > 2.

Výsledky a diskuse

Křivka dávka-odezva

Metoda využívá kompetitivní vazby mezi konjugátem enzymu a volným analytem ve vzorku pro pevné množství vazebných míst protilátky, úměrné jejich koncentraci ve směsi. Křivky dávka-odpověď pro DPH byly připraveny v syntetické negativní moči a syntetické negativní krvi při koncentracích popsaných dříve. B0 je absorbance negativního kalibrátoru a B představuje absorbance jednotlivých hladin kalibrátoru. Procentuální poměr jednotlivých kalibrátorů k negativnímu kalibrátoru (B/B0) byl vypočten pro každou úroveň kalibrátoru a vynesen do grafu v závislosti na koncentraci léčiva (ng/ml) jak pro moč, tak pro krev (obrázek 3). Hodnoty B/B0 jsou nepřímo úměrné koncentraci léčiva ve vzorku, a to z toho důvodu, že čím vyšší je koncentrace léčiva, tím méně konjugátu léčiva a enzymu se váže na protilátku, čímž vzniká nižší hodnota absorbance.

.