Hodnocení mikrobiální diverzity denitrifikačních bakterií ve vsádkovém reaktoru

BIOPROCESS ENGINEERING

Hodnocení mikrobiální diverzity denitrifikačních bakterií ve vsádkovém reaktoru

S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*

ABSTRACT

Mikrobiální společenstva v průmyslovém zařízení s aktivovaným kalem mohou přispívat k procesu denitrifikace, ale informací o mikroorganismech přítomných v denitrifikačních reaktorech je stále málo. Odstranění anorganických sloučenin dusíku lze dosáhnout přidáním zdrojů uhlíku do biologického procesu denitrifikace. Ethanol je ekonomicky životaschopnou alternativou jako zdroj uhlíku v tropických zemích, jako je Brazílie, kde se ve velkém měřítku vyrábí z cukrové třtiny. Tento článek informuje o úspěšné aplikaci aktivovaného kalu s dusičnany a ethanolem ve vsádkovém anaerobním reaktoru. Provoz trval 61,5 h s celkovou spotřebou dusičnanů za 42,5 h, tvorbou dusitanů (2,0 mg/l) a spotřebou ethanolu (830,0 mg/l) za 23,5 h. Počty denitrifikačních buněk podle nejpravděpodobnějšího počtu na začátku provozu byly nižší než na konci, což potvrzuje schopnost inokula z aktivovaného kalu pro proces denitrifikace. Vzorky z počtu buněk byly identifikovány jako Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. a nekultivované bakterie. Tyto druhy se tedy mohou podílet na redukci dusičnanů a spotřebě etanolu ve vsádkovém reaktoru.

ÚVOD

Mikroorganismy schopné denitrifikace jsou široce rozšířené v přírodě: v půdě, sedimentech, sladkých vodách, mořích a systémech čištění odpadních vod (Park & Yoo, 2009).

Mnoho inokul z domácích a průmyslových čistíren odpadních vod může obsahovat denitrifikační bakterie, především v systémech aktivovaného kalu (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), kde dochází k biologickému odstraňování dusíku na podporu denitrifikace, tj. za heterotrofních anoxických podmínek působí organické zdroje uhlíku jako donory elektronů a redukují dusičnany na plynný dusík (Canto et al., 2008). Pro heterotrofní denitrifikaci je nezbytná přítomnost organického uhlíku a zdrojů energie (Nava et al., 2010).

Většina denitrifikačních bakterií je zahrnuta ve fyziologii Proteobacteria, kam patří mimo jiné Acidovorax, Comamonas a Acinetobacter. Tyto bakterie mohou být přítomny při zpracování odpadů, zejména v systémech s aktivovaným kalem, které jsou schopny tvořit molekulární dusík z dusičnanů a exogenního zdroje uhlíku, jako je etanol. Úplnou denitrifikaci, tj. přeměnu dusičnanů na plynný dusík, zprostředkovávají druhy bakterií, které normálně využívají jako zdroj energie kyslík ze vzduchu (aerobní dýchání), ale mají také schopnost využívat místo kyslíku dusičnany a dusitany (anoxický stav). Tyto bakterie tedy mohou růst aerobně v nepřítomnosti dusičnanů nebo za anoxických podmínek v přítomnosti dusičnanů. Přeměna dusičnanů na molekulární dusík je také známá jako anoxická respirace (Park & Yoo, 2009).

Byla použita široká škála organických sloučenin, například methanol, ethanol, glukóza, acetát, aspartát nebo kyselina mravenčí a aromatické sloučeniny (Queiroz et al., 2011). Většina publikovaných výzkumů týkajících se denitrifikace pitné vody však zahrnuje použití methanolu, ethanolu a kyseliny octové (Park & Yoo, 2009). Ethanol (Daniel et al., 2009), glukóza a acetát jsou některé z vnějších donorů elektronů úspěšně používaných pro denitrifikaci. Zejména v Brazílii představuje etanol schůdnou alternativu (Gavazza dos Santos et al., 2004). Etanol se v Brazílii vyrábí ve velkém měřítku od roku 1975 v rámci Národního programu pro alkohol (19751985). Brazílie produkuje téměř 2,6 x 108 tun cukrové třtiny, kterou zpracovává 324 cukrovarů na cukr a etanol (Borrero et al., 2003). Z cukrové třtiny se vyrábí hojně a obvykle stojí méně než jiné vhodné zdroje uhlíku. Nicméně potřeba dalších zdrojů donorů elektronů pro exogenní proces zvyšuje provozní náklady, což může představovat nevýhodu pro využití inovativních technologií založených na anaerobním procesu (Gavazza dos Santos et al.,

Stechiometrické vztahy popisující energetickou reakci bakterií (Park & Yoo, 2009) jsou při použití ethanolu jako zdroje uhlíku zapsány takto:

0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O

Ačkoli tato rovnice odhaluje stechiometrické množství ethanolu potřebné pro disimilaci dusičnanů, další ethanol je nutný pro odkyselení a syntézu buněk. V praxi se pro syntézu bakteriálních buněk používá 25 % až 30 % potřebného ethanolu. Pokud je přítomen rozpuštěný kyslík, je potřeba ethanolu odpovídajícím způsobem vyšší. Proto je běžná pracovní hodnota hmotnostního poměru substrátu a dusičnanů (C:N03) téměř 3 (Park & Yoo, 2009).

O vsádkových reaktorech a procesu denitrifikace existuje pouze několik odkazů. Tyto konfigurace lze použít ke zkoumání nutričních požadavků (Maintinguer et al., 2008). Proces denitrifikace s komplexními sacharidy se hodnotí ve vsádkových reaktorech, protože pevné organické látky, které jsou v těchto systémech přítomny, mohou ztížit provoz v jiných konfiguracích, například se škrobem (Iamamoto, 2006). Ve srovnání s reaktory s kontinuálním průtokem navíc zůstává biomasa ve vsádkovém reaktoru zachována po celou dobu provozu. Tyto skutečnosti mohou přispět k celkové spotřebě dusičnanů ověřené ve vsádkovém reaktoru (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).

Odstraňování dusičnanů pomocí inokula aktivovaného kalu bylo studováno zejména v zemích mírného klimatu. Existuje jen málo zpráv o studiích odstraňování dusičnanů a molekulární biologie s inokulem aktivovaného kalu z tropických zemí, jako je Brazílie. V tomto smyslu bylo prvním cílem naší studie vyhodnotit proces denitrifikace s aktivovaným kalem jako inokulem z tropických klimatických oblastí. Druhým cílem naší studie bylo provést mikrobiální charakterizaci inokula s cílem identifikovat potenciální organismy specificky zapojené do procesu denitrifikace.

Tato práce studovala mikrobiální diverzitu denitrifikace ve vsádkovém reaktoru krmeném etanolem a dusičnany pomocí technik molekulární biologie a tradiční metodiky mikrobiologie.

MATERIÁL A METODY

Várkový reaktor

Pokus byl proveden s kalem ze systému aktivovaného kalu z čistírny odpadních vod ve Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brazílie).

Vsádkové reaktory byly připraveny ve třech opakováních v baňkách Duran® o objemu 2 l, kde 1 l tvořilo reakční médium, 10% (v/v) inokulum (100 ml/l).

Reaktory byly po rozdělení roztoků vystaveny atmosféře N2 (99,99 %) po dobu 20 min. Poté byly uzavřeny butylovými pryžovými zátkami, zabaleny a uchovávány při teplotě 25 ºC ± 1 ºC, přičemž míchání při 120 otáčkách za minutu probíhalo po dobu 61,5 h.

Fyzikálně-chemická a chromatografická analýza

Celkové těkavé látky (TVS) a spotřeba dusičnanů byly stanoveny podle APHA, 2005, spektrofotometricky. Analýza dusitanů byla provedena průtokovým nástřikem (FIA APHA, 2005). Těkavé mastné kyseliny a alkoholy byly stanoveny plynovou chromatografií v přístroji Shimadzu GC-2010, vybaveném plamenoionizačním detektorem, autosamplerem pro headspace COMBI-PAL – AOC model 5000 a kolonou HP-INNOWAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm tloušťka filmu), podle Maintinguera et al., 2008).

Kvantifikace denitrifikačních bakterií

Nejpravděpodobnější počet (MPN) denitrifikačních bakterií byl proveden při pětinásobném ředění na začátku a na konci provozu vsádkového reaktoru podle Tiedjeho (1982), upraveného pro kapalné vzorky. Počty buněk metodou MPN byly provedeny po 15 dnech inkubace podle APHA, 2005. Složení kultivačního média a, koncentrace dusičnanů a etanolu použité při testech MPN byly podobné jako při provozu vsádkového reaktoru, jak bylo uvedeno výše.

Molekulární biologie

Vzorky pro analýzu 16S rRNA byly získány z nejvyšších pozitivních počtů ředění (MPN) denitrifikačních bakterií na konci testu ze vsádkových reaktorů.

Celková genomová DNA vzorků byla získána po lýze buněk skleněnými kuličkami (Sigma) a fenol-chloroformové extrakci, jak již dříve popsali Griffiths et al. modifikovaně (2000).

Amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) byla provedena pomocí sady primerů s bakteriální doménou pro gen 16S rRNA, 27 forward (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) a 1100 reverse (5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). Amplifikace PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22,331) byla provedena s počáteční denaturací při 94 ºC po dobu 5 min, následovanou 30 cykly denaturace při 94 ºC po dobu 45 s, žíhání při 55 ºC po dobu 45 s, extenze při 72 ºC po dobu 1,45 min a konečné extenze při 72 ºC po dobu 7 min a ochlazení při 4 ºC.

Vzorky produktů PCR (polymerázová řetězová reakce) (16S rRNA) byly klonovány do plazmidového vektoru pGEM (Promega Easy Vector System I) podle specifikací výrobce. Klony byly náhodně vybrány a amplifikovány pomocí PCR. Sekvenování nukleotidů bylo provedeno na automatickém sekvenátoru ABI 310 PRISM (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) v souladu s pokyny výrobce za použití přímého primeru M13 (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983). Amplifikace PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) byla provedena s počáteční denaturací při 94 ºC po dobu 2 minut, následovanou 25 cykly denaturace při 94 ºC po dobu 1 minuty, žíhání při 55 ºC po dobu 1 minuty, extenze při 72 ºC po dobu 1 minuty; a konečná extenze při 72 ºC po dobu 7 minut a ochlazení při 4 ºC.

Nukleotidové sekvence byly zpracovány a byly zarovnány pomocí programu Seqman (balík Lasergene DNAstar), aby se odstranily signály z vektoru a nekvalitní báze. Zarovnané sekvence byly určeny pomocí vyhledávacího programu BLAST na webových stránkách NCBI a porovnány se sekvencemi genů 16S rRNA organismů zastoupených v databázi Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) a Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). Fylogenetický strom byl sestaven metodou Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) pomocí programu MEGA verze 4.1 (Kumar et al., 2008). K odhadu spolehlivosti topologie stromu byla provedena analýza Bootstrap resampling pro 1000 opakování. Byly přidány známé sekvence Aspergillus niger (FJ828924.1), které byly použity jako out-group.

VÝSLEDKY A DISKUSE

Dusičnany byly zcela spotřebovány po 42,5 h provozu (obr. 1). Tvorba dusitanů byla snížena (2,0 mg/l v 18,5 h) a došlo k ní během 23,5 h provozu. Při počáteční koncentraci 1 650 mg/l bylo po 13,5 h provozu zjištěno 1,06 g etanolu/l (36% spotřeba). Spotřeba ethanolu na konci experimentu byla 54 % (0,77 g/l za 61,5 h). Tyto výsledky se téměř shodovaly s výsledky Gusmão et al. (2006). Autoři (op.cit.) pozorovali 98,9 % spotřeby dusičnanů za 14 h provozu s přečištěnými buňkami granulovaného kalu z anaerobní kalové deky (UASB), která čistí odpadní vody z drůbežích jatek (DAKAR-Tietê SP Brazílie), s dusičnany (350 N-NO3 mg/l), ethanolem (377 mg/l) a benzenem (10 mg/l) jako zdroji uhlíku.

Na začátku pokusu byl zjištěn metanol (197,78 mg/l) a n-butanol (23,50 mg/l). Tyto alkoholy (metanol a n-butanol) byly pravděpodobně přítomny v inokulaci. Koncentrace alkoholů vykazovala až do konce testu malé změny, což naznačuje, že za těchto denitrifikačních podmínek nebyly spotřebovány (obr. 2).

Maximální tvorba kyseliny octové byla 16,7 mg/l po 61,5 hodinách provozu. Hodnoty STV na začátku a na konci provozu vsádkového reaktoru byly 5,14 g/l a 11,40 g/l, což znamená nárůst biomasy o 122 %. Tyto výsledky ukázaly, že provozní podmínky kladené na vsádkový reaktor prospěly rozvoji a stálosti bakteriálního konsorcia v denitrifikačních podmínkách.

V této studii byl pozorován proces denitrifikace, který popsali i jiní autoři při použití různých konfigurací reaktorů.

Callado & Foresti (2001) provozoval anaerobní reaktory napájené syntetickým substrátem simulujícím domácí odpadní vody, aby odstranil největší podíl uhlíkatých látek a podpořil nitrifikaci substrátu, denitrifikaci a biologické odstraňování fosfátů ve stejném dávkovém cyklu, v sekvenčním anaerobním/aerobním/anaerobním dávkovém reaktoru. Systém byl provozován 41 dní s 84 cykly po 12 hodinách při teplotě 28 ± 1 ºC. Autoři (op. cit.) zjistili, že denitrifikace probíhala v reakční fázi střídavě za aerobních a anoxických podmínek. Oba procesy probíhaly pouze tehdy, když byl na začátku anoxické fáze přidán octan sodný (500 mg/l).

Etchebehere et al. (2001) testovali acetát (40 mmol/l) a glukózu (13 mmol/l) jako zdroje uhlíku pro denitrifikaci v anaerobním vsádkovém reaktoru s dusičnanem draselným (20 mmol/l) pro tři různé inokula: kal z anoxického reaktoru (laboratorní měřítko) k odstraňování uhlíku a dusíku z výluhu ze skládky odpadů; kal z metanogenního reaktoru UASB zpracovávajícího slad a kal z anoxického reaktoru krmeného acetátem a dusičnanem. Dusičnany byly ze tří testovaných vzorků kalů zcela spotřebovány, jak bylo zjištěno v této studii. Autoři (op. cit.) dospěli k závěru, že acetát je lepším zdrojem uhlíku než glukóza.

Gavazza dos Santos et al. (2004) studovali proces denitrifikace prováděný ve vsádkových reaktorech napájených syntetickou odpadní vodou simulující nitrifikované odpadní vody z domovních čistíren odpadních vod za použití tří zdrojů donorů elektronů: methanolu (53,3 mg/l), ethanolu (38,3 mg/l) a methanu (kromě syntetické odpadní vody). Autoři (op.cit.) pozorovali, že nejúčinnějším donorem elektronů byl ethanol, který zcela odstranil dusitany a dusičnany, jak bylo pozorováno v této práci.

Iamamoto (2006) dosáhl odstranění dusíku většího než 84 % v sekvenčním vsádkovém reaktoru krmeném škrobem a amoniem při střídání anoxických a aerobních podmínek (cykly 2h/2h) a 2 mg O2/L pro následující koncentrace: 125 mg N-NH4/L a 0,95 g škrobu/L, 250 mg N-NH4/L a 1,9 g škrobu/L, 500 mg N-NH4/L a 3.8 g škrobu/l, s inokulem ze systému aktivovaného kalu čistírny odpadních vod (Flores da Cunha Rio Claro SP Brazílie). Jako zdroj uhlíku byl testován také etanol (1 500 mg/l) spolu s 500 mg NH4-N/l. Autoři (op.cit.) pozorovali, že odstranění dusitanů a dusičnanů bylo úplné (100 %), jak bylo pozorováno v této studii, což dokazuje možnost použití ethanolu v procesu denitrifikace.

Počty denitrifikačních buněk podle MPN na začátku provozu vsádkového reaktoru byly nižší (1,1 x 1010 MPN/ml) než na konci provozu (1,2 x 1019 MPN/ml) (obr. 3). Tyto výsledky jsou vyšší než výsledky uváděné v literatuře, popsané níže.

Etchebehere et al. (2001) počítali denitrifikační buňky podle nejpravděpodobnějšího počtu (MPN) v základním médiu doplněném kvasničným extraktem (0,5 g/l), octanem draselným (1,84 g/l) a dusičnanem draselným (0,72 g/l) a získali 9,6 x 106 MPN/ml s kalem z anoxického reaktoru systému zpracování výluhu. Callado a Foresti (2001) použili octan sodný jako zdroj uhlíku v sekvenčním anaerobním/ aerobním/anaerobním vsádkovém reaktoru a zjistili více MPN denitrifikačních bakterií na začátku provozu (2,5 x 106 MPN/ml) než na konci (3,5 x 105 MPN/ml). Autoři (op.cit.) dospěli k závěru, že tento pokles neměl vliv na proces denitrifikace.

Iamamoto (2006) získal stejný řád v MPN denitrifikačních bakterií na konci provozu sekvenčního vsádkového reaktoru s 250 mg N-NO3/l (3,9 x 106 MPN/mL) a 500 mg N-NO3/l (1,105 MPN/mL).1 x 106 MPN/ml), v obou případech s přídavkem škrobu (1 900 mg/l) jako zdroje uhlíku a inokula z aktivovaného kalu z čistírny odpadních vod (Rio Claro SP – Brazílie).

Denitrifikační bakterie byly zvýhodněny nutričními podmínkami zavedenými v anoxickém reaktoru. Tato skutečnost potvrdila schopnost inokula z aktivovaného kalu pro denitrifikační proces.

Z analyzovaného vzorku bylo získáno 50 klonů pro klonování a sekvenování fragmentů genu 16S rRNA mikrobiálního konsorcia. Klony s hodnotami menšími než 180 nukleotidů však nebyly zahrnuty do fylogenetické analýzy, protože nebyly dostatečné pro porovnání s níže popsanou databází. Sekvence z klonování a sekvenování byly získány ze vzorku s nejvyšším pozitivním ředěním MPN (10-18) (tabulka 1).

Acinetobacter sp. byl identifikován s podobností: 98 % (klony 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 a 2, 4, 18, 20, 23 a 27) a 99 % (klony 6, 15, 16, 37 a 38). Jedná se o gramnegativní bakterii, nepohyblivou, oxidáza-negativní, nefermentující, v párech a patří do fylogeneze Proteobacteria, čeledi Moraxellaceae. Je to významný mikroorganismus v půdě, kde může přispívat k mineralizaci např. aromatických sloučenin (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) izolovali kmeny Acinetobacter ve vzorku ze systému aktivovaného kalu (Jizhuangzi Tianjin – Čína). Tento kmen byl schopen biodegradovat fenol (1,1 g/l) pomocí volných i imobilizovaných buněk. Geng et al. (2006) izolovali bakterie rozkládající fenol ve vzorku ze systému zpracování aktivovaného kalu (Singapur). Biochemické testy ukázaly, že tyto mikroorganismy mohou růst v přítomnosti ethanolu, glukózy, sacharózy a aromatických sloučenin, jako je toluen, fenol a benzoát. Byl popsán jako nový druh Acinetobacter EDP3. Autoři (op.cit.) dospěli k závěru, že tento druh lze využít k odstraňování fenolových sloučenin nebo k bioremediaci in situ fenolu v půdě. Cai et al. (2009) identifikovali 58 rezistentních bakterií z půdy kontaminované arsenem. Ve vysokých koncentracích (20 mM Ar/L) byly identifikovány kmeny Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas a Stenotrophomonas. Acinetobacter sp. identifikované v této práci měly svůj růst v důsledku stanovených provozních podmínek a mohly přispívat k denitrifikaci.

Klony 24 a 26 byly podobné Comamonas sp. s podobností 98 % a 97 %. Comamonas jsou gramnegativní bakterie patřící do rodu Proteobacteria Phylum, čeledi Comamonadaceae. Etchebehere et al. (2001) izolovali gramnegativní denitrifikační bakterie z anoxického reaktoru používaného pro čištění skládkových výluhů v Montevideu (Uruguay). Izolovaný druh byl podobný druhu Comamonas terrigena. Tento mikroorganismus byl však považován za nový druh, pojmenovaný Comamonas nitrativorans. Byl popsán jako gramnegativní bakterie, s polárním bičíkem, aerobní a chemoorganotrofní. Tento druh rostl v ethanolu, acetátu a butyrátu, dusičnanech, dusitanech a může redukovat dusičnany na N2.

Tedy druh Comamonas identifikovaný v této studii byl přítomen v inokulu aktivovaného kalu a mohl přispívat k denitrifikaci, ke které došlo v testech.

Klony 25, 28, 34, 36, 42 a 65 byly podobné Acidovorax sp. s podobností 99 %, resp. 97 % (tab. 1). Acidovorax sp. patří do rodu Proteobacteria Phylum; snadno se vyskytuje v systémech aktivovaného kalu. Mnoho druhů Acidovorax působí v systémech aktivovaného kalu jako regulační mikroorganismy mikrobiologických čisticích procesů. Několik druhů rodu Acidovorax se využívá při biodegradaci plastů a při odstraňování dalších organických kontaminantů, včetně nitrofenolů, nitrobenzenu a polychlorovaných bifenylů pomocí denitrifikace (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) izolovali denitrifikační druhy bakterií rozkládající PHBV (poly-3-hydroxy-butyrát-co-3-hydroxyvalerát) ze tří systémů aktivovaného kalu, používaných k čištění komunálních odpadních vod (Nagoya, Osaka a Toyohashi – Japonsko). Analyzovaných 37 klonů vykazovalo podobnost s organismy patřícími do třídy Betaproteobakterií. Většina klonů vykazovala podobnost s druhem Acidovorax, což potvrzuje, že se tento druh podílí na rozkladu PHBV za denitrifikačních podmínek. Gentile et al (2007) izolovali druhy podobné Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium a Achromobacter z denitrifikačního reaktoru provozovaného s ethanolem (40,0 g/l) a kyselinou mléčnou (40,0 g/l) jako zdroji uhlíku; donory elektronů testovali odděleně a jako zdroj dusíku byl použit dusičnan (1,9 g NaNO3/l; 2,3 g KNO3/l). Autoři (op. cit.) dospěli k závěru, že úplnou redukci dusičnanů na N2 prováděly druhy Acidovorax, zatímco Achromobacter sp. a Delftia acidovorans byly zodpovědné za neúplnou denitrifikaci dusičnanů na dusitany. Ve vzorcích analyzovaných v této studii byly tedy přítomny druhy rodu Acidovorax, které by se mohly podílet na denitrifikaci, k níž docházelo ve vsádkovém reaktoru.

Byly identifikovány nekultivované bakteriální kmeny z čeledi Rhodocyclaceae s 98% podobností (klon 9 – AY945917.1 a klony 46, 84 AY945905), jak je uvedeno v tab. 1. Členové čeledi Rhodocyclaceae jsou gramnegativní bakterie patřící do třídy betaproteobakterií. Jsou to denitrifikační aerobní tyčinky s všestrannou metabolickou kapacitou. Většina druhů žije ve vodních biotopech a v oligotrofních půdních podmínkách. Mnoho z nich se vyskytuje v odpadních vodách a hrají důležitou roli při biologické dekontaminační úpravě těchto míst (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006) krmili denitrifikační reaktor chinolinem (40 mg/l), toxickým aminem používaným při výrobě barviv, pesticidů a syntetických paliv, glukózou (180 mg/l), dusičnany a fosforečnanem draselným (C/N/P 150:30:1). Inokulum pocházelo z druhé sedimentační nádrže systému čištění odpadních vod v průmyslovém podniku Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Šanghaj – Japonsko). Odstranění chinolinu bylo 90,2 % po ustáleném období reaktoru (6 týdnů). Molekulárně biologické analýzy inokula a z denitrifikačního reaktoru odhalily v obou testech nekultivované bakterie Thauera a Azoarcus. Podle autorů bylo procento klonů příslušejících k bakteriím Azoarcus a Thauera 74 % v denitrifikačním reaktoru a 4 % v inokule. Poznání mikroorganismů ze vzorků životního prostředí je závislé na laboratorních podmínkách s čistými kulturami (Pace, 1997). Je však známo méně než 1 % bakterií z různých ekosystémů (Amann, 1995), resp. zhruba 99 % nebylo studováno a identifikováno. Proto jsme v této práci očekávali získání podobných sekvencí nekultivovaných bakterií.

Fylogenetický strom získaný pomocí konsensuálních primerů domény Bacteria v molekulárně biologických analýzách experimentu je znázorněn na obrázku 4.

Koeficienty podobnosti mezi jednotlivými skupinami mikroorganismů byly 97 % až 99 % a naznačovaly přítomnost fylogeneticky příbuzných druhů na základě částečného vyhodnocení sekvencí genu 16S rRNA. Známé sekvence druhů pocházely z databáze NCBI s Aspergillus niger (FJ828924.1) jako sekvencí mimo skupinu.

Takže druhy Acidovorax, Comamonas a Acinetobacter identifikované v této studii byly přítomny v systému aktivovaného kalu Volkswagen São Carlos Motors a mohly se podílet na redukci dusičnanů a spotřebě etanolu.

ZÁVĚRY

Potenciál inokula ze systému aktivovaného kalu a využití ethanolu jako zdroje uhlíku v procesu denitrifikace byl prokázán ve vsádkovém reaktoru.

Hodnoty MPN denitrifikačních bakterií získané v této studii spolu s výsledky pro odstraňování dusičnanů ukázaly, že v inokule ze systému aktivovaného kalu byly denitrifikační bakterie, které byly zvýhodněny uloženými nutričními podmínkami.

Identifikované klony měly fylogenetickou příslušnost k fylu Proteobacteria, třídě Alphaproteobacteria a Gamaproteobacteria, s Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. a nekultivovanými bakteriemi. Tyto bakterie by se mohly podílet na redukci dusičnanů a spotřebě etanolu v anoxickém vsádkovém reaktoru.

PODĚKOVÁNÍ

Autoři děkují za granty získané od FAPESP a CNPq.

APHA, AWWA a WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22. vydání, American Public Health Association, Washington, DC (2005).

Iamamoto, C. Y., Nitrogen removal in sequencing batch reactor with suspended biomass treating high ammonia concentration wastewater (Odstraňování dusíku v sekvenčním dávkovacím reaktoru se suspendovanou biomasou při čištění odpadních vod s vysokou koncentrací amoniaku). Doktorská disertační práce, University of São Paulo, Brazílie, School of Engineering, University of São Carlos, Brazílie (2006).

Messing, J., Nové vektory M13 pro klonování. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).

Pace, N. R., Molekulární pohled na mikrobiální rozmanitost a biosféru. Science, 276, 734-740 (1997).