Gertruda Steinová se narodila 3. února 1874 v Allegheny v Pensylvánii bohatým německo-židovským přistěhovalcům. Ve třech letech se její rodina přestěhovala nejprve do Vídně a poté do Paříže. Do Ameriky se vrátili v roce 1878 a usadili se v Oaklandu v Kalifornii. Její matka Amelia zemřela v roce 1888 na rakovinu a otec Daniel zemřel v roce 1891.
Steinová navštěvovala v letech 1893-1897 Radcliffe College, kde se specializovala na psychologii u známého psychologa Williama Jamese. Po odchodu z Radcliffe se zapsala na Univerzitu Johnse Hopkinse, kde čtyři roky studovala medicínu, kterou opustila v roce 1901. Ani na jedné z těchto institucí Steinová nezískala formální diplom.
V roce 1903 se Steinová přestěhovala do Paříže k Alici B. Toklasové, mladší přítelkyni ze San Franciska, která zůstala její partnerkou a sekretářkou po celý život. Do Spojených států se pár vrátil až po více než třiceti letech. Během první světové války spolu sloužily jako dobrovolnice a vozily zásoby do nemocnic ve Francii.
Společně s Toklasovou a jejím bratrem Leem, uměleckým kritikem a malířem, si Steinová zařídila byt na levém břehu. Jejich dům, rue de Fleurus 27, se brzy stal místem setkávání mnoha mladých umělců a spisovatelů, včetně Henriho Matisse, Ezry Pounda, Pabla Picassa, Maxe Jacoba a Guillauma Apollinaira.
Byla vášnivou zastánkyní „nového“ v umění, její literární přátelství se rozrostlo o tak různorodé spisovatele, jako byli William Carlos Williams, Djuana Barnes, F. Scott Fitzgerald, James Joyce a Ernest Hemingway. Právě pro Hemingwaye Steinová vymyslela výraz „ztracená generace“, kterým označila spisovatele žijící mezi válkami v zahraničí.
V roce 1913 Steinová podporovala kubistické malíře a její stále avantgardnější psaní způsobilo rozchod s bratrem Leem, který se přestěhoval do Florencie. Její první kniha Tři životy vyšla v roce 1909. V roce 1914 po ní následovala kniha Něžné knoflíky (Claire Marie), která jasně ukázala, jak hluboký vliv mělo moderní malířství na její psaní. V těchto drobných básních v próze se obrazy a věty spojují často překvapivým způsobem – podobně jako v kubistické malbě. Její psaní, pro které je charakteristické používání slov spíše pro jejich asociace a zvuky než pro jejich významy, se setkalo se značným zájmem dalších umělců a spisovatelů, ale nenašlo si široké publikum.
Mezi nejvlivnější díla Steinové patří The Making of Americans (1925); How to Write (1931); The Autobiography of Alice B. Toklas (1933), která se stala bestsellerem, a Stanzas in Meditation and Other Poems (1956). Sherwood Anderson v úvodu ke knize Geography and Plays (1922) napsal, že její psaní „spočívá v přestavbě a úplně novém přetvoření života ve městě slov.“
Steinová zemřela v americké nemocnici v Neuilly 27. července 1946 na neoperovatelnou rakovinu.