00:00:07.25Dobrý den, jmenuji se Jennifer Doudna z Kalifornské univerzity v Berkeley
00:00:09.26a jsem tu dnes, abych vám pověděla o tom, jak jsme odhalili
00:00:12.26novou technologii genomového inženýrství.
00:00:15.07Tento příběh začíná bakteriálním imunitním systémem
00:00:20.12což znamená pochopit, jak bakterie
00:00:22.14bojují proti virové infekci.
00:00:24.26Ukázalo se, že mnoho bakterií
00:00:28.04mají ve svém chromozomu,
00:00:30.09což je to, na co se zde díváte
00:00:32.15sekvence opakování znázorněná těmito černými diamanty
00:00:36.18které jsou proloženy sekvencemi
00:00:40.19které pocházejí z virů
00:00:43.08a těchto si všimli mikrobiologové
00:00:46.20kterí sekvenovali bakteriální genomy, ale nikdo nevěděl
00:00:50.10jakou funkci by tyto sekvence mohly mít
00:00:53.06až se zjistilo, že mají tendenci se vyskytovat také
00:00:58.09s řadou genů, které často kódují proteiny
00:01:03.29které mají homologii s enzymy, které dělají zajímavé věci
00:01:09.03jako je oprava DNA.
00:01:10.12Takže vznikla hypotéza, že tento systém
00:01:14.04který se začal nazývat CRISPR
00:01:16.08což je zkratka pro tento typ repetitivních lokusů
00:01:19.14že tyto CRISPR systémy by mohly být vlastně
00:01:22. A tak jsme se dostali k tomu, že jsme se rozhodli, že tento systém CRISPR budeme nazývat CRISPR.29získaný imunitní systém v bakteriích
00:01:26.00který by mohl umožnit integraci sekvencí
00:01:29.06z virů a později je nějakým způsobem použít
00:01:32.07k ochraně buňky před infekcí
00:01:35.26se stejným virem.
00:01:37.05Takže to byla zajímavá hypotéza
00:01:39.11a my jsme se zapojili do jejího studia
00:01:41.18v polovině roku 2000, hned po publikaci
00:01:44. Na základě této hypotézy jsme se snažili zjistit, zda je to možné.15tří prací, které poukázaly
00:01:47.13na začlenění virových sekvencí
00:01:50.00do těchto genomových lokusů.
00:01:52.07A tak se během několika následujících let ukázalo
00:01:55.17že ve skutečnosti tyto systémy CRISPR
00:01:58.08jsou skutečně získané imunitní systémy u bakterií
00:02:01.18takže až do této chvíle nikdo nevěděl, že bakterie
00:02:04.24mohou mít vlastně způsob, jak se adaptovat
00:02:08.08na viry, které se dostanou do buňky
00:02:10. V tomto okamžiku se ukázalo, že bakterie jsou skutečně schopné se adaptovat.29ale toto je způsob, jak to dělají
00:02:12.14a zahrnuje detekci cizí DNA
00:02:15.17která se vstříkne, jak je ukázáno v tomto příkladu
00:02:18.04z viru, který se dostane do buňky
00:02:20. To je způsob, jak se adaptovat.07systém CRISPR umožňuje integraci
00:02:26.06krátkých kousků těchto virových molekul DNA
00:02:29.15do lokusu CRISPR
00:02:31.07a pak v druhém kroku
00:02:33.27který je zde znázorněn jako biogeneze CRISPR RNA
00:02:38.20Tyto sekvence CRISPR jsou skutečně přepisovány
00:02:42.20v buňce do kousků RNA
00:02:45.15které jsou následně použity společně
00:02:48.23s proteiny kódovanými geny CAS
00:02:52.09těchto genů asociovaných s CRISPR
00:02:54.01k vytvoření interferujících nebo interferenčních komplexů
00:02:58.12které mohou využít informace v podobě
00:03:01.17těchto molekul RNA k párování bází
00:03:04.08s odpovídajícími sekvencemi ve virové DNA.
00:03:07.18Takže velmi šikovný způsob, na který bakterie
00:03:10.12přišly, aby vzaly své útočníky
00:03:13.06a obrátily sekvenční informaci proti nim.
00:03:17.00Takže v mé vlastní laboratoři
00:03:20.21jsme se dlouhou dobu velmi zajímali
00:03:23.09o pochopení toho, jak molekuly RNA
00:03:26.03pomáhají buňkám zjistit
00:03:32.00jak regulovat expresi proteinů
00:03:34. V této laboratoři jsme se snažili zjistit, jakým způsobem lze regulovat expresi proteinů.03z genomu.
00:03:35.05A tak se to zdálo být také velmi zajímavým
00:03:37.27příkladem a
00:03:39.18začali jsme studovat základní molekulární mechanismy
00:03:42.24podle kterých tato dráha funguje.
00:03:45.01A v roce 2011 jsem jel na vědeckou konferenci
00:03:49.23a potkal jsem svou kolegyni,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentierovou, která je na tomto obrázku
00:03:56.10zcela vlevo, a Emmanuellinu laboratoř
00:03:58. V roce 2011 jsem byl na vědecké konferenci, kde jsem se seznámil s její laboratoří.14pracuje na mikrobiologických problémech a zajímají se
00:04:02.11zejména o bakterie
00:04:04.00které jsou lidskými patogeny.
00:04:06.01Studovala organismus, který se jmenuje
00:04:08.03Streptococcus pyogenes, což je bakterie
00:04:11.15která může způsobovat velmi závažné infekce u lidí
00:04:14.25a na tomto broukovi bylo zajímavé, že
00:04:16.25má systém CRISPR a v tomto organismu
00:04:19.06byl tam jediný gen kódující protein
00:04:21.27známý jako Cas9
00:04:23.12který byl geneticky prokázán jako nezbytný
00:04:26.09pro funkci systému CRISPR
00:04:28.16ve Streptococcus pyogenes,
00:04:30.23ale nikdo v té době nevěděl, jaká je funkce
00:04:33.05 tohoto proteinu.
00:04:34.20A tak jsme se sešli a získali
00:04:37.20lidi z našich příslušných výzkumných laboratoří
00:04:40.26aby jsme začali testovat funkci Cas9.
00:04:43.17Takže klíčoví lidé v projektu
00:04:45.20jsou zobrazeni tady na fotografii
00:04:48.00uprostřed je Martin Jinek
00:04:50.03který je postdoktorandem v mé vlastní laboratoři
00:04:52. Na fotografii je vidět, že jsme se dohodli, že budeme pracovat na projektu.17a vedle něj v modré košili
00:04:54.22je Kryztof Chylinski, který byl studentem
00:04:57.20v laboratoři Emmanuelle
00:04:58.26a tak tito dva pánové spolu s
00:05:00.21Ines Fonfarou, která je úplně vpravo,
00:05:02. Je to můj kolega.10a postdoktorandkou Emmanuelle
00:05:04.01začali dělat experimenty na druhé straně Atlantiku
00:05:07.25a sdílet svá data.
00:05:10.09A přišli na to, že
00:05:13.06Cas9 je vlastně fascinující protein
00:05:16.
.04který má schopnost interagovat s DNA
00:05:19.28a vytvářet dvouvláknový zlom
00:05:22.02v DNA v sekvencích, které odpovídají
00:05:25.06sekvenci ve vodicí RNA
00:05:27. V tomto případě se jedná o protein, který je schopen vytvářet dvouvláknové zlomy.08a na tomto snímku vidíte
00:05:29.06, že vodicí RNA
00:05:30.10a sekvence vodiče oranžově
00:05:32.11se páruje s jedním vláknem
00:05:34.18dvojšroubovice DNA
00:05:37.11a co je velmi důležité, tato RNA
00:05:39.28interaguje s druhou molekulou RNA
00:05:42.09zvanou tracr, která vytváří strukturu
00:05:46.03která rekrutuje protein Cas9
00:05:47.29takže tyto dvě RNA a jeden protein
00:05:50.13v přírodě jsou potřebné
00:05:52.23pro to, aby tento protein rozpoznal
00:05:56.05co by za normálních okolností byla virová DNA
00:05:58.11v buňce a protein
00:06:01.13je schopen je rozřezat,
00:06:02. To je to, co je potřeba k tomu, aby tento protein rozpoznal.14doslova tím, že rozbije dvojitou šroubovici DNA.
00:06:05.24A tak když jsme na to přišli
00:06:08.14pomysleli jsme si: nebylo by úžasné
00:06:10.26 kdybychom skutečně mohli vytvořit jednodušší systém
00:06:13?29což příroda dokázala
00:06:15.02spojením těchto dvou molekul RNA
00:06:18.04vytvořit systém, který by byl jedinou bílkovinou
00:06:20.16a jedinou vodící RNA.
00:06:22.
.28Takže myšlenka byla v podstatě vzít
00:06:25.17tyto dvě RNA, které vidíte na druhé straně
00:06:29.29screenu, a pak je v podstatě spojit dohromady
00:06:33.19a vytvořit to, čemu říkáme
00:06:35.04jediná vodící RNA.
00:06:36.22Takže Martin Jinek v laboratoři
00:06:38.25vyrobil tento konstrukt
00:06:40.21a my jsme udělali velmi jednoduchý experiment
00:06:44.22aby jsme otestovali, jestli opravdu máme
00:06:46.18programovatelný enzym štěpící DNA
00:06:49. A my jsme udělali velmi jednoduchý experiment
00:06:46.18.29a myšlenkou bylo vytvořit krátké jednotlivé vodicí RNA
00:06:54.04které rozpoznávají různá místa v kruhové molekule DNA
00:06:59.24které vidíte zde
00:07:00.21a vodicí RNA byly navrženy
00:07:03.10aby rozpoznaly sekvence znázorněné červenými čarami
00:07:06.17na diapozitivu a experimentem pak bylo
00:07:10.16vzít tento plazmid, tuto kruhovou molekulu DNA
00:07:13.21a inkubovat ji se dvěma různými restrikčními (nebo řezacími) enzymy,
00:07:18.27jedním z nich se nazývá SalI, který řeže
00:07:21.23druhé místo DNA, které je na tomto obrázku
00:07:25.05dále proti proudu
00:07:26.12v šedém rámečku,
00:07:27.19a druhé místo je nasměrované
00:07:31.00pomocí RNA řízené Cas9
00:07:33.13na těchto různých místech zobrazených červeně.
00:07:35.16A velmi jednoduchý experiment
00:07:37.19provedli jsme tuto inkubační reakci
00:07:39.26s plazmidovou DNA a toto je výsledek
00:07:43.24a tak toto je to, na co se díváte
00:07:45.28je agarózový gel
00:07:47.29který nám umožňuje oddělit
00:07:49.16rozštěpené molekuly DNA
00:07:51. V tomto případě se jedná o agarózový gel.20a můžete vidět, že v každém z těchto reakčních pruhů
00:07:54.22získáme různě velkou molekulu DNA uvolněnou
00:07:58.12z tohoto dvakrát štěpeného plazmidu
00:08:00.16v níž je velikost DNA
00:08:03.29odpovídá štěpení na různých místech
00:08:06.11usměrňovaných těmito vodicími sekvencemi RNA
00:08:08.26označenými červeně
00:08:10.24takže to byl opravdu vzrušující okamžik
00:08:12.29vlastně velmi jednoduchý experiment, který byl
00:08:15 .15jako „Aha!“ moment
00:08:17.03když jsme si řekli, že opravdu máme programovatelný enzym na řezání DNA
00:08:22.02a že ho můžeme naprogramovat pomocí krátkého kousku RNA
00:08:24.15na štěpení v podstatě libovolné dvouřetězcové sekvence DNA
00:08:28.07takže důvod, proč jsme byli tak nadšeni
00:08:30.23z enzymu, který lze naprogramovat
00:08:33.19k vytváření dvouvláknových zlomů DNA
00:08:36.01na jakékoli sekvenci, je ten, že
00:08:39.00existoval dlouholetý soubor experimentů
00:08:42.16ve vědecké komunitě, který ukázal
00:08:45.13že buňky mají způsoby, jak opravovat dvouvláknové zlomy DNA
00:08:49.26které vedou ke změnám
00:08:52.02v genomové informaci v DNA
00:08:55.21takže toto je slajd, který ukazuje, že
00:08:58.20po vzniku dvouvláknového zlomu
00:09:01.14jakýmkoli enzymem, který by to mohl udělat
00:09:04.13včetně systému Cas9
00:09:06.05tyto dvouřetězcové zlomy v buňce
00:09:09.07jsou detekovány a opraveny dvěma typy cest
00:09:13.15jedna vlevo, která zahrnuje
00:09:17.26nehomologické spojování konců
00:09:20.07které konce DNA jsou chemicky spojeny
00:09:24.07zpět dohromady obvykle se zavedením
00:09:26.18malé inzerce nebo delece
00:09:28.25v místě zlomu
00:09:29.27a na pravé straně
00:09:32.01je další způsob, jakým dochází k opravě
00:09:34.00pomocí homologicky řízené opravy
00:09:37.22při které dárcovská molekula DNA
00:09:39.14která má sekvence, které odpovídají těm
00:09:43.28obklopující místo
00:09:45.12dvojvláknového zlomu mohou být integrovány
00:09:48.05do genomu v místě
00:09:50.10 zlomu, aby se do genomu
00:09:54.06vnesla nová genetická informace
00:09:55.15takže to vnuklo mnoha vědcům
00:09:59.04 myšlenku, že kdyby existoval nástroj
00:10:01.04nebo technologie, která by umožnila
00:10:03.05vědcům nebo výzkumníkům zavádět
00:10:06.12dvojvláknové zlomy na cílených místech
00:10:09. Vědci nebo výzkumníci by se mohli rozhodnout, jestli se jim to podaří.00v DNA buňky pak společně
00:10:12.12se všemi daty sekvenování genomu
00:10:14.21které jsou nyní k dispozici, známe
00:10:16.10celou genetickou sekvenci buňky
00:10:18.21a kdybyste věděli, kde došlo k mutaci
00:10:21.20která způsobuje například onemocnění
00:10:23.20mohli byste skutečně použít technologii, jako je tato
00:10:26.25k zavedení DNA, která by mutaci opravila
00:10:31.00nebo vytvořit mutaci
00:10:32.23 kterou byste chtěli studovat ve výzkumném prostředí
00:10:35.04takže síla této technologie je
00:10:38.28vlastně myšlenka, že nyní můžeme generovat
00:10:41.20tyto typy dvouvláknových zlomů
00:10:43.17na místech, která si jako vědci vybereme
00:10:46.17naprogramováním Cas9, a pak umožníme
00:10:48.13buňce provést opravy, které zavedou
00:10:51.04genomické změny v místech těchto zlomů
00:10:54.15ale problémem bylo, jak tyto zlomy
00:10:58.11v první řadě vytvořit, a tak byla vytvořena řada
00:11:00.09různých strategií
00:11:03.24jak to v různých laboratořích
00:11:05 provést.15většina z nich, a já zde ukážu
00:11:08.21dva konkrétní příklady
00:11:10.17jedna se nazývá nukleázy se zinkovým prstem
00:11:12.25a druhá TAL efektorové domény
00:11:15.02obě jsou programovatelné způsoby
00:11:18 .08pro vytváření dvouvláknových zlomů v DNA
00:11:20.21které se budou spoléhat na rozpoznávání sekvencí DNA na základě proteinů
00:11:23.29, takže se jedná o proteiny
00:11:26.06které jsou modulární a mohou být generovány
00:11:29.12v různých kombinacích modulů
00:11:31.22pro rozpoznávání různých sekvencí DNA
00:11:34.03funguje to jako technologie
00:11:37.18ale vyžaduje to hodně proteinového inženýrství
00:11:40.24pro to, a co je opravdu vzrušující
00:11:43.16o tomto enzymu CRISPR/Cas9
00:11:46.11je to, že je to protein programovaný RNA
00:11:49.25takže jediný protein lze použít pro
00:11:52.09jakékoli místo DNA, kde bychom
00:11:54.27chtěli vytvořit zlom
00:11:56. To je velmi zajímavé.13jednoduše změnou sekvence
00:11:58.16 vodicí RNA spojené s Cas9
00:12:00.24takže místo spoléhání se na rozpoznání DNA na základě proteinu
00:12:03.06 spoléháme na
00:12:06.04 rozpoznání DNA na základě RNA
00:12:08.26jak je uvedeno dole, takže to znamená
00:12:11.03že je to prostě systém
00:12:12.18který je dostatečně jednoduchý, aby ho mohl používat
00:12:15.15kdokoli se základním vzděláním v molekulární biologii
00:12:19.05může využít tento systém
00:12:20.29pro genomové inženýrství
00:12:22.20a je to tedy nástroj, který skutečně
00:12:26.06myslím, že doplňuje podstatnou
00:12:29.03a dříve chybějící složku
00:12:30.24toho, co bychom mohli nazvat sadou IT nástrojů biologie
00:12:33.29která zahrnuje nejen schopnost
00:12:36.00sekvenovat DNA a podívat se
00:12:38.06na její strukturu, víme o
00:12:39.24dvojité šroubovici od padesátých let minulého století
00:12:42. To znamená, že se nám podařilo zjistit, jaká je její struktura.00a pak v posledních několika desetiletích
00:12:44.18bylo možné použít enzymy
00:12:46.09jako restrikční enzymy
00:12:47.26a polymerázovou řetězovou reakci
00:12:49.09k izolaci a amplifikaci určitých segmentů
00:12:52.19 DNA a nyní s Cas9
00:12:55.10máme technologii, která umožňuje
00:12:57.15důkladné genomové inženýrství
00:12:59.13které je k dispozici laboratořím po celém světě
00:13:03.07pro experimenty, které by mohli chtít provádět
00:13:05.08a to je tedy shrnutí technologie
00:13:10.11dvousložkového systému
00:13:11.29spoléhá na paring bází RNA-DNA
00:13:14.16pro rozpoznávání
00:13:15.21a velmi důležité je, že díky způsobu
00:13:18.24který tento systém funguje, je vlastně docela jednoduché
00:13:19.28provádět něco, čemu se říká multiplexování
00:13:24.20což znamená, že můžeme naprogramovat Cas9
00:13:27.00s více různými vodicími RNA
00:13:28.23v téže buňce generovat
00:13:30.19více zlomů a dělat věci
00:13:32.06jako vystřihnout velké segmenty chromozomu
00:13:35.01a jednoduše je odstranit v jednom experimentu.
00:13:38.25A tak to vedlo ke skutečné explozi
00:13:42.03v oblasti biologie a genetiky
00:13:45.19s mnoha laboratořemi po celém světě
00:13:48.08přijímajícími tuto technologii
00:13:49.25pro nejrůznější velmi zajímavé
00:13:51.15a kreativní druhy aplikací
00:13:53.13a tohle je slajd
00:13:54.24který už je vlastně téměř zastaralý
00:13:56.11ale abychom vám dali představu
00:13:57.14o tom, jak se tato oblast
00:14:00.07skutečně rozjela
00:14:01.08takže jsme publikovali naši původní práci o Cas9
00:14:04. Je to velmi zajímavé.10v roce 2012 a do té doby
00:14:07.16bylo velmi málo výzkumu
00:14:08.18probíhajícího na poli biologie CRISPR všude
00:14:11.12byl to velmi malý obor
00:14:12.19a pak můžete vidět, že
00:14:13.27začínaje rokem 2013 a rozšiřováním
00:14:16.09až do současnosti došlo k této
00:14:17.21neuvěřitelné explozi publikací
00:14:20.16z laboratoří, které využívají
00:14:22.09tohoto jako technologie genomového inženýrství
00:14:24.01takže to pro mě bylo opravdu velmi vzrušující
00:14:26.25jako pro základního vědce vidět, jak se to, co začalo
00:14:29.22jako projekt základního výzkumu
00:14:31.12proměnilo v technologii, která se ukazuje
00:14:34.08jako velmi umožňující pro všechny druhy
00:14:35.28zajímavých experimentů
00:14:37.07a na závěr jsem se s vámi chtěl podělit
00:14:40.07o několik věcí
00:14:42.17které se dějí pomocí této technologie
00:14:44.17takže samozřejmě na levé straně
00:14:47.13spousta základní biologie, kterou lze nyní provádět
00:14:50.02s inženýrstvím modelových organismů
00:14:53.03a různých druhů buněčných linií
00:14:55.02které se kultivují v laboratoři
00:14:56.21pro studium chování buněk
00:14:58. Na druhé straně je možné zkoumat, jak se buňky chovají.13ale také v biotechnologiích, které jsou schopny
00:15:01.23provádět cílené změny v rostlinách
00:15:05.15a různých druzích hub, které by mohly být velmi
00:15:07.11užitečné pro různé druhy průmyslových aplikací
00:15:09.29a pak samozřejmě v biomedicíně
00:15:12.14s velkým zájmem o potenciál
00:15:14.14použít tuto technologii jako nástroj
00:15:17.03pro skutečné vymýšlení nových terapií
00:15:21.06pro lidská onemocnění, myslím, že je to něco
00:15:23.09což je velmi vzrušující a je to opravdu něco
00:15:26.05co už je na obzoru
00:15:27.09a pak tento slajd jen opravdu naznačuje
00:15:30.20kam si myslím, že to bude směřovat
00:15:33.15v budoucnu se spoustou zajímavých
00:15:36.20a kreativních směrů
00:15:39.03které se objevují v různých laboratořích
00:15:41.02jak v akademických výzkumných laboratořích
00:15:43.19ale také stále více v komerčních laboratořích
00:15:45.29které umožní využití této
00:15:49.24technologie pro nejrůznější aplikace
00:15:52.18mnohé z nich jsme si ještě před dvěma lety ani nedokázali
00:15:54.10představit.
00:15:56.05Takže velmi vzrušující a chci jen ocenit skvělý tým
00:16:01.10lidí, kteří se podíleli na práci
00:16:04.22na tomto projektu se mnou, a také jsme
00:16:06.07měli úžasnou finanční podporu od různých skupin
00:16:11.00a bylo mi potěšením
00:16:13.00sdílet to s vámi, děkuji.
.