Metodické přístupy
Genetika CAVD je historicky spojována s CF od roku 1968, kdy Kaplan a kol. prokázali, že téměř všichni muži s CF mají obstrukční azoospermii (OA) způsobenou CBAVD (Kaplan a kol. 1968). Představa, že izolované formy CBAVD a cystické fibrózy jsou spojeny se stejným genem, byla potvrzena krátce po identifikaci genu CFTR v roce 1989 (Dumur et al. 1990; Anguiano et al. 1992). Brzy však bylo zjištěno, že 20-40 % případů CBAVD není spojeno s mutacemi CFTR, což naznačuje možnost genetické heterogenity (Culard et al. 1994; Chillón et al. 1995). Nicméně po dobu 25 let zůstala genetika CAVD omezena na CFTR. Faktem je, že studium genetické determinace lidské neplodnosti bylo dlouho omezeno specifickými metodologickými omezeními, přičemž tradiční rodinné přístupy pomocí analýzy vazeb byly často nepoužitelné, zejména v souvislosti s mužskou neplodností kvůli psychosociálním a kulturním bariérám. Proto se donedávna genetické markery běžně používané v klinické praxi při zkoumání neobstrukční azoospermie (NOA) omezovaly na chromozomální abnormality, jako je Klinefelterův syndrom a mikrodelece chromozomu Y (Krausz 2011). V posledním desetiletí však nástup sekvenování nové generace (NGS) umožnil rozvoj výkonných přístupů založených na sekvenování celého exomu (WES) nebo sekvenování celého genomu (WGS) a analýze celého transkriptomu. V poslední době bylo identifikováno přibližně 20 genů podílejících se na monogenních formách NOA (přehled Ghieh et al. 2019). Téměř u všech těchto genů byly v příbuzenských rodinách identifikovány kauzální mutace, všechny recesivní (Yang et al. 2018). Na druhou stranu, pokud je nám známo, výjimečné rodinné případy OA nebyly nikdy pozorovány v kontextu konsanguinity, což je omezení, které částečně vysvětluje, proč je navzdory vybavení novými genomickými přístupy počet nových genů identifikovaných u CAVD mnohem nižší. Nicméně v posledních letech přispěly k identifikaci kandidátních genů dva hlavní komplementární přístupy; přístupy založené na studiu jednotlivých genomů a přístupy založené na analýze transkriptomu buněk semenných kanálků, především nadvarlat. První z nich vedl ke zjištění relevantních korelací mezi iCBAVD a bodovými mutacemi genu ADGRG2 identifikovanými pomocí analýzy WES (Patat et al. 2016; Khan et al. 2018), jakož i změnami v počtu kopií genů PANK2 a SLC9A3 identifikovanými pomocí analýzy komparativní genomové hybridizace založené na array (array-CGH) (Lee et al. 2009). Transkriptomické přístupy využívající cDNA microarray nebo sekvenování RNA se podařilo zaměřit na mnoho funkčních kandidátních genů, zejména na geny, jejichž exprese je omezena na buňky semenného kanálku nebo jejichž expresní profil je specifický pro určité části semenného kanálku (Browne et al. 2016). Některé z těchto kandidátních genů, jako jsou ADGRG2 a SLC9A3, byly ověřeny u knockoutovaných myší a jejich fyziologie byla na tomto zvířecím modelu zkoumána (Davies et al. 2004; Wang et al. 2017). Nedávno vedl integrativní multiomický přístup, který kombinuje WGS, analýzu metylomu celé DNA a sekvenování RNA, k identifikaci dvou nových kandidátních genů, SCNN1B a CA12, u jedince s iCBAVD (Shen et al. 2019). Navzdory těmto pokrokům však stále neexistuje genetická diagnóza pro nejméně čtvrtinu CAVD, z nichž většinu tvoří CUAVD. Hypotéza, že tyto nevysvětlitelné formy CAVD nejsou důsledkem prostých genetických variací, byla dosud jen málo prozkoumána. Lze předpokládat, že v budoucnu nové metody studia epigenomu a síla bioinformatických nástrojů umožní upřesnit roli epigenomické regulace při výskytu těchto ojedinělých CAVD. Tento přístup však bude o to úspěšnější, pokud bude aplikován na dostatečně velké kohorty složené z dokonale fenotypizovaných pacientů s CAVD homogenního etnického původu.
Geny podílející se na vzniku CAVD
Zatímco genetická determinace NOA se vyznačuje značnou genetickou heterogenitou s více než 30 identifikovanými geny (SPGF ), genetická determinace OA je omezena na velmi málo genů (Ghieh et al. 2019). Proto bylo zjištěno, že přibližně tři čtvrtiny případů NOA u kavkazské populace jsou spojeny s anomáliemi ve dvou genech: CFTR u většiny případů a ADGRG2 u menšiny (Patat et al. 2016). Na některých iCBAVD se mohou podílet i další geny, například SLC9A3, ale také epigenetické nebo environmentální faktory s velmi odlišnou fyziopatologickou rolí.
CFTR (MIM#602421) byl identifikován pozičním klonováním v roce 1989 Riordanem et al. (1989), čímž skončil několikaletý konkurenční výzkum s cílem objevit jediný gen odpovědný za CF. Přibližně polovina pacientů s CF severoevropského původu je homozygotní pro deleci tří párů bází (NM_000493.3:c.1521_1523del), která vede ke ztrátě fenylalaninu 508 (NP_000483.3:p.Phe508del, starší název: F508del). V kavkazské populaci je v průměru 1 ze 40 jedinců heterozygotem pro mutaci p.Phe508del, což z ní činí jednu z nejčastějších lidských patogenních mutací (Kerem et al. 1989). CFTR, který pokrývá 250 kb na dlouhém raménku chromozomu 7 v oblasti 7q31.2, obsahuje 27 kódujících exonů a produkuje několik transkriptů, z nichž pouze jeden, mRNA o velikosti 6,1 kb, kóduje funkční protein o 1480 aminokyselinách zvaný CF transmembránový regulátor vodivosti (CFTR). CFTR je glykosylovaný transmembránový protein exprimovaný na apikální membráně mnoha epiteliálních buněk, kde funguje především jako chloridový kanál regulovaný cAMP. Mnoho studií ukázalo, že CFTR se podílí na regulaci několika iontových přenašečů včetně sodíkového kanálu (ENacs), chloridových/bikarbonátových výměníků, protonových výměníků (Na+/H+) a vodních kanálů (aquaporinů). Fyziologické procesy závislé na CFTR proto hrají klíčovou roli při udržování homeostázy iontů, pH a vody v sekrečních epiteliálních tekutinách (Choi et al. 2001). Za tři desetiletí bylo zaznamenáno více než 2000 mutací v CFTR (https://www.genet.sickkids.on.ca/), ale méně než čtvrtina z nich je klasifikována jako patogenní (https://www.cftr2.org/) na základě korelace s CF nebo jinými stavy, které mají často méně závažnou prognózu, omezené na jeden orgán, jako jsou průdušky (diseminovaná bronchiektázie, MIM#211400), slinivka břišní (chronická pankreatitida, MIM#167800) nebo chámovody (vrozená oboustranná absence chámovodů, MIM#277180). Tyto stavy, které nesplňují všechna kritéria cystické fibrózy, ale souvisejí s dysfunkcí CFTR, byly sdruženy pod obecný termín CFTR-RD (Bombieri et al. 2011). Mutacemi způsobujícími onemocnění mohou být postiženy všechny oblasti CFTR včetně promotorových oblastí a hlubokých intronických oblastí (Feng et al. 2019; Bergougnoux et al. 2019). V závislosti na jejich vlivu na biogenezi a funkce CFTR se patogenní alely dělí do dvou hlavních kategorií: Varianty způsobující CF (nazývané také „závažné“), které jsou v homozygotním stavu vždy spojeny s CF, a varianty nezpůsobující CF, které nebyly u pacientů s CF nikdy pozorovány, a které jsou proto mylně označovány jako „mírné“ alely. Menšina alel způsobujících CF byla pozorována u variabilních klinických forem více či méně závažné cystické fibrózy, u nichž je funkce pankreatu často zachována. Patogenita těchto alel označovaných jako VCC (pro varianty s různými klinickými důsledky) může záviset na zřídka známých genetických faktorech, jako je cis asociace s komplexními alelami nebo neznámé negenetické faktory. Na rozdíl od variant způsobujících CF způsobují varianty nezpůsobující CF neúplnou dysfunkci CFTR. V závislosti na orgánu, pokud je zbytková aktivita CFTR příliš nízká pro udržení homeostázy, může se objevit CFTR-RD. Proto jsou osoby s CFTR-RD obvykle nositeli varianty, která není příčinou CF, nejčastěji v kombinaci s variantou způsobující CF nebo vzácněji s jinou variantou, která není příčinou CF. Tyto alely se někdy označují jako alely způsobující CFTR-RD.
ADGRG2 (MIM#300372) umístěný v Xp22.13 se skládá z 29 exonů, které vytvářejí přibližně deset transkriptů, z nichž nejdelší má otevřený čtecí rámec o velikosti 3,1 kb (pokrývá exony 3-29), které kódují adhezivní G proteinem spřažený receptor G2 (ADGRG2). Jeho cDNA byla původně klonována v roce 1997 Osterhoffem et al. (1997) po diferenciálním screeningu knihovny lidských epididymálních cDNA, v níž byl tento klon, pojmenovaný HE6 (pro lidský epididymis-specifický protein 6), značně zastoupen. Protein HE6 s odvozenou sekvencí 1017 aminokyselin a svými sedmi vysoce zachovalými transmembránovými doménami patří do nadrodiny receptorů spřažených s G proteinem (GPCR), v níž byl původně označován jako GPR64. Struktura a autokatalytická vlastnost extracelulární části HE6/GPCR64 vedly k jeho konečnému zařazení do podrodiny G adhezních GPCR (aGPCR) (Hamann et al. 2015). ADGRG2 je vysoce glykosylovaný protein téměř výhradně a vysoce exprimovaný v proximální části samčích semenných kanálků (https://proteinatlas.org), přesněji v epitelu eferentních kanálků a počáteční části nadvarlete. Imunoznačení ADGRG2 je zvláště silné ve stereocíliích hlavních epididymálních buněk a v mikroviliích neciliovaných buněk eferentních kanálků, kde se reabsorbuje 90 % tekutiny vylučované varletem (Kirchhoff et al. 2008; Patat et al. 2016). Zapojení ADGRG2 do tohoto procesu původně naznačilo vyřazení HE6/GPR64 (cílené narušení) u myší, které u hemizygotních samců vede k hromadění tekutiny ve varleti a stagnaci spermií v eferentních kanálcích vedoucí k obstrukčnímu fenotypu neplodnosti (Davies et al. 2004). ADGRG2 je osiřelý receptor s neznámými přirozenými ligandy a částečně objasněnými signálními cestami. Stejně jako většina aGPCR je i zralý ADGRG2 heterodimer vzniklý štěpením ve velmi zachovalé doméně obsahující místo proteolýzy GPCR (GPS) v extracelulárním N-terminálním fragmentu (NTF) nekovalentně připojeném k velkému C-terminálnímu fragmentu (CTF) ukotvenému v buněčné membráně (Obermann et al. 2003). Jak tyto dvě podjednotky spolupracují pod vlivem endogenních agonistů při zprostředkování signálů a zda mají samostatné specifické funkce, jsou otázky, které zůstávají nezodpovězeny. Bylo však prokázáno, že extracelulární konec CTF vzniklý štěpením nese Stachelovu sekvenci s agonistickými vlastnostmi (Demberg et al. 2015). Kromě toho nedávná experimentální data získaná v modelech in vitro a in vivo ukazují, že prostřednictvím signalizace zprostředkované proteiny Gs a Gq je ADGRG2 schopen modulovat aktivitu c-AMP, respektive PKC (Demberg et al. 2017; Balenga et al. 2016; Zhang et al. 2018).
Kausální mutace u CAVD, typ a epidemiologie
Mutace CFTR
Méně než rok po identifikaci genu CFTR (Riordan et al. 1989) pozorovali Dumur et al. abnormálně vysokou frekvenci mutace p.Phe508del u malé série neplodných mužů s iCBAVD (Dumur et al. 1990). Tento objev, který podpořil hypotézu, že iCBAVD může být monosymptomatickou formou cystické fibrózy, měl závažný medicínský důsledek. Poté měli být všichni muži s iCBAVD podstupující technologie lékařsky asistované reprodukce (ART) pomocí chirurgického odběru spermií a intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI) považováni za muže s vyšším rizikem narození dítěte s cystickou fibrózou (Anguiano et al. 1992). Následně Chillon et al. potvrdili, že na rozdíl od pacientů s CF, kteří nesou pouze mutace způsobující CF, jež jsou zodpovědné za úplnou ztrátu funkce chloridového kanálu CFTR, pacienti s iCBAVD nesou alespoň jednu kopii CFTR s tzv. mírnou mutací, protože ta koreluje se sníženou nebo částečnou aktivitou CFTR o 3-8 % (Chillón et al. 1995). Tuto situaci dobře ilustruje varianta polythymidinového (Tn) polymorfismu v intronu 9 (NM_000493.3:c.1210-12T), tzv. alela IVS8-5T (alela 5T), jejíž frekvence je u osob s iCBAVD čtyřikrát až pětkrát vyšší (přehled v De Sousa et al. 2018). Tato alela 5T má škodlivý vliv na sestřih, který podporuje přeskočení exonu 10, což vede k významnému snížení normální CFTR mRNA (Chu et al. 1993). Až třetina osob s iCBAVD evropského původu jsou složení heterozygoti nesoucí mutaci způsobující CF, nejčastěji F508del, a alelu 5T in trans (Chillón et al. 1995). Protože však tento genotyp byl pozorován u plodných otců, kteří měli dítě s CF, Cuppens et al. ukázali, že penetrance této alely 5 T s ohledem na vynechání exonu 10 závisí především na velikosti polymorfní sekvence polyTG (NM_000493.3:c.1210-34TG) před sekvencí polyT (Cuppens et al. 1998). Zatímco tedy polyvarianta TG(11)5T (NM_000493.3:c.1210-34TGT) se vyskytuje v drtivé většině u zdravých osob, u osob s iCBAVD se nejčastěji vyskytuje kombinace TG(12)5T, zatímco mnohem vzácnější alela TG(13)5T je u osob s iCBAVD identifikována vždy (Groman et al. 2004). Během posledních 20 let umožnily četné studie charakterizovat spektrum mutací CFTR u subjektů s CBAVD upřesněním jejich frekvence podle etnického původu a geografického původu (přehled v Yu et al. 2012). Zatímco u subjektů s CF-CBAVD i iCBAVD se vyskytují stejné typy závažných mutací, včetně velkých přestaveb CFTR (Taulan et al. 2007), mutační spektrum CFTR u iCBAVD se radikálně liší v tom, že se zde vyskytuje mnoho mutací nezpůsobujících CF, z nichž většina může být spojena s jinými fenotypy CFTR-RD, jako jsou pankreatopatie, diseminované bronchiektázie a sinonazální poruchy (Bombieri et al. 2011). Tyto „mírné“ mutace zahrnují především intronické varianty, které ovlivňují sestřih, z nichž nejčastější je alela 5T, a četné missense mutace, které ovlivňují fungování chloridového kanálu, z nichž nejčastější u kavkazské populace je mutace p.Arg117His (R117H) (Casals et al. 2000; Claustres et al. 2000). Většina těchto mutací, které nejsou příčinou CF, není detekována rutinními panely určenými pro klasickou populaci CF, které se zaměřují především na nejčastější mutace způsobující CF (četné dostupné komerční soupravy). Proto se pro molekulární diagnostiku CBAVD a dalších CFTR-RD doporučuje zvolit jako test první volby CFTR test, který zahrnuje dvě hlavní „mírné“ varianty, R117H, a alelu 5T (viz níže kapitola „Důsledky pro klinickou praxi …“). Pokud je tento test neprůkazný, měla by být provedena komplexní charakterizace CFTR, zahrnující přinejmenším sekvenování všech exonů a doprovodných intronických oblastí a také pátrání po velkých přestavbách. Molekulární diagnostické metody založené na sekvenování nové generace (NGS) se stále častěji používají k detekci nejen bodových mutací, ale také rozsáhlých delecí nebo duplikací. Tyto nové metody skenování genů, které lze použít na panel, umožňují vyhnout se pracnému Sangerovu sekvenování a semikvantitativním technikám PCR (MLPA, QMPSF, qPCR atd.) prováděným exon po exonu.
Frekvence mutací CFTR u pacientů s CAVD se v jednotlivých studiích liší, což je pravděpodobně způsobeno zkreslením náboru, velikostí kohorty a heterogenitou metod genotypování, přičemž u mnoha subjektů byla provedena částečná analýza CFTR. Je však zřejmé, že frekvence některých alel je velmi odlišná u kavkazských pacientů s CAVD a u pacientů z jiných než kavkazských zemí, v nichž je cystická fibróza mnohem vzácnější. To je zejména případ mutace F508del, která je výjimečně detekována u čínských pacientů s iCBAVD, zatímco v severní Evropě je nositelem až třetina pacientů s iCBAVD. Na druhou stranu pacienti s iCBAVD asijského původu jsou častěji nositeli alely 5T než běloši (tabulka 1), zatímco frekvence této alely v běžné populaci se ve světě liší jen málo (5 %). Celkově metaanalýza údajů publikovaných Yu et al (2012) ukazuje, že přibližně 80 % kavkazských pacientů s iCBAVD je nositeli alespoň jedné mutace v CFTR. Nejúplnější možná studie ponechává 6 % subjektů bez zjištěné mutace (Ratbi et al. 2007). Vezmeme-li v úvahu, že někteří z těchto pacientů mohou být prostí heterozygoti (3 % v kavkazské populaci) a další jsou nositeli variant neznámého významu, které jsou pravděpodobně neutrální (nezpůsobují CF ani CFTR-RD), lze předpokládat, že CFTR se bude podílet na 75-80 % případů iCBAVD. Přibližně u čtvrtiny pacientů s iCBAVD tedy nelze odpovědnost CFTR definitivně prokázat, zatímco u pacientů s CF lze obě mutované alely charakterizovat v 99 % případů (tabulka 1). U CUAVD nese 30-50 % subjektů po komplexním vyšetření genů alespoň jednu mutaci CFTR, což znamená, že více než polovina CUAVD nesouvisí s CFTR (Schlegel et al. 1996; Casals et al. 2000; Cai et al. 2019; Mieusset et al. 2020). Přítomnost renální abnormality je velmi výrazně častější u pacientů s CAVD, u nichž byla zjištěna pouze jedna nebo žádná abnormalita CFTR (Augarten et al. 1994; Schwarzer & Schwarz 2012). Lze tedy předpokládat, že rozdíl v míře nedetekování mutací CFTR mezi CBAVD (20 %) a CUAVD (50 %) alespoň částečně souvisí s rozdílem ve frekvenci jednostranné ageneze ledvin pozorované v obou skupinách, 5 % vs. 25 % (Weiske et al. 2000; McCallum et al. 2001; Kolettis a Sandlow 2002; Yang et al. 2015).
Mutace ADGRG2
V roce 2016 po pečlivém výběru z velké retrospektivní série 379 mužů iCBAVD evropského původu kohorty 26 jedinců, kteří neměli ani mutaci CFTR, ani přidruženou abnormalitu ledvin, Patat et al. identifikovali tři hemizygotní zkracující mutace v genu ADGRG2 (MIM#300572.0001_3) vázaném na chromozom X u čtyř jedinců (Patat et al. 2016). Stanovení kauzální role těchto mutací ve fenotypu iCBAVD bylo založeno na souboru argumentů: (i) u samců ADGRG2 knockoutovaných (KO) myší se vyvinula OA bez jiných významných abnormalit (Davies et al. 2004), (ii) histologické vyšetření epididymální biopsie jednoho ze čtyř jedinců prokázalo nedostatek exprese ADGRG2 v epitelu eferentních duktulů, které byly abnormálně rozšířené, (iii) jedna ze zkrácených mutací byla identifikována u dvou neplodných jedinců příbuzných mateřskou vazbou (synovec a strýc z matčiny strany). Od té doby tři publikace (Yang et al. 2017; Yuan et al. 2019; Khan et al. 2018) informovaly o identifikaci pěti nových vzácných variant ADGRG2 u šesti pacientů s iCBAVD asijského původu bez patogenní mutace CFTR: dvě nonsense mutace klasifikované jako patogenní, včetně jedné u dvou neplodných bratrů pákistánského původu (Khan et al. 2018) a tři missense mutace, včetně jedné postihující oblast GPS, která byla klasifikována jako patogenní (Yang et al. 2017). Těchto šest pacientů nemělo žádné renální abnormality. Nedávno Pagin et al. rovněž zaznamenali šest nových zkracujících mutací ADGRG2 v kohortě 53 francouzských pacientů s CAVD nesoucích 0 nebo pouze 1 defektní alelu CFTR. V této studii se autorům nepodařilo získat přesvědčivé důkazy na podporu hypotézy o digenické dědičnosti zahrnující ADGRG2 a CFTR. Došli k závěru, že inaktivace ADGRG2 je zodpovědná za přibližně 20 % případů CAVD, které nesouvisejí s dysfunkcí CFTR. Kromě toho mezi 8 pacienty s mutací ADGRG2 v jejich souboru nezjistili žádný případ solitární ledviny (Pagin et al. 2019). Zajímavé je, že v kohortě 28 pacientů s iCBAVD s URA Patat et al. neidentifikovali žádné mutace ADGRG2 ani CFTR (osobní údaje).
Jiné mutace
Podle našich znalostí jsou kromě CFTR a ADGRG2 jedinými dalšími mutacemi, které vyvolaly otázku možné souvislosti s iCBAVD, CNV zahrnující geny PANK2 a SLC9A3. Tyto CNV byly dosud popsány pouze u pacientů s iCBAVD z Tchaj-wanu. Stejně jako v jiných asijských populacích se CF a CFTR-RD na Tchaj-wanu vyskytují zřídka a kromě alely IVS8-5T, jejíž frekvence je významně zvýšena u neplodných tchajwanských mužů s iCBAVD, bylo charakterizováno jen velmi málo patogenních alel CFTR (Chiang et al. 2009). Při zkoumání CNV pomocí array-CGH a kvantitativní PCR v reálném čase u malé kohorty tchajwanských jedinců s iCBAVD identifikoval tým HS Chiang u jediného jedince homozygotní ztrátu genu pro pantothenátkinázu 2 (PANK2) (Lee et al. 2009) a u 11 z 29 subjektů ztrátu kopie genu pro izoformu 3 rodiny přenašečů solutů 9 (SLC9A3) (Wu et al. 2018; přehled Chiang et al. 2019). PANK2 byl vybrán jako potenciální gen související s reprodukcí, protože KO myš měla azoospermii (Kuo et al. 2005). Jednalo se však o NOA a tento stav není pozorován u postižených lidí s neurodegenerací spojenou s pantothenátkinázou (MIM#234200). Dosud nebyly hlášeny žádné další případy CBAVD související s delecí PANK2. Souvislost proto zůstává nejistá a pozorování neoficiální. Na druhou stranu experimentální údaje získané stejným týmem o zapojení SLC9A3 do fenotypu CBAVD jsou podstatné a přesvědčivější. Tito autoři totiž prokázali, že u dospělých myších samců SLC9A3-/- dochází k obstrukční azoospermii v důsledku strukturálních a funkčních abnormalit eferentních kanálků s dlouhodobou progresivní atrofií chámovodů a semenných váčků (Wu et al. 2019; Chiang et al. 2019). Pozoruhodné je, že autoři u těchto SLC9A3-KO myší pozorovali drastický pokles CFTR v nadvarleti a chámovodech, což naznačuje vzájemně závislou roli těchto dvou genů v determinismu iCBAVD (Wang et al. 2017). Navzdory těmto velmi poučným pozorováním o úloze SLC9A3 ve fyziologii reprodukčního traktu myších samců je však vztah mezi ztrátou kopie tohoto genu a iCBAVD u lidí stále málo známý. Vzhledem k tomu, že recesivní mutace SLC9A3 způsobují těžkou formu vrozeného průjmu vylučováním sodíku (congenital secretory sodium diarrhea, MIM#616868) a že bylo prokázáno, že mutace se ztrátou funkce, včetně úplné delece SLC9A3, se přenášejí heterozygotními otci (Janecke et al. 2015), nelze CBAVD tchajwanských pacientů vysvětlit pouze haploinsuficiencí SLC9A3. Wu et al. navíc ve své studii uvedl, že mezi 29 tchajwanskými pacienty s iCBAVD byl u 6 (20,7 %) zjištěn homozygotní nebo složený heterozygot pro alely CFTR TG(12)5T nebo TG(13)5T, což je genotypový stav, který by sám o sobě mohl být dostatečným důvodem iCBAVD. Z těchto šesti jedinců měli dva pouze jednu kopii SLC9A3. Ze stejné kohorty bylo 12 dalších pacientů s iCBAVD heterozygoty pro alelu TG(12)5T nebo TG(13)5T, z nichž polovina měla rovněž deleci SLC9A3 (Wu et al. 2019). Možnost digenismu zahrnujícího varianty CFTR, jako je alela 5T, je stále velmi spekulativní. Je třeba poznamenat, že žádný z těchto 29 tchajwanských pacientů s CBAVD neměl jednostrannou absenci ledvin.