Při kryokonzervaci biologického vzorku se molekulární pohyb a buněčné procesy zpomalí až do bodu skelného přechodu, kdy se veškerá aktivita zastaví, a buňky, tkáně a dokonce i celé organismy zůstanou zachovány po mnoho let. Není proto překvapením, že kryokonzervace je základem většiny moderních biobankovních operací.
Ačkoli je však koncept zmrazení jednoduchý, fyzikální proces je poměrně složitý. Způsob, jakým zmrazení nebo vitrifikace probíhá, může mít dramatický dopad na životaschopnost buněk a kvalitu vzorků po jejich návratu do vyšších teplot.
Fyzikální vlastnosti ledu a hlavní děje při zmrazování a rozmrazování vzorků (které je stejně důležité jako chlazení) budeme zkoumat v sérii příspěvků na blogu, které se budou zabývat procesem zmrazování hlouběji. V tomto prvním příspěvku začneme od začátku a podíváme se na první krok mrznutí, nukleaci.
Čistá voda ochlazená pod bod mrazu může zůstat přechlazenou kapalinou, dokud není narušena. (Níže uvedené video nabízí skvělou ilustraci tohoto bodu a je skvělým domácím vědeckým experimentem, který můžete vyzkoušet s dětmi!)
Na videu je úderem do láhve s vodou vytvořeno místo pro vznik ledových krystalků, jinými slovy místo pro nukleaci. Nukleace je proces, při kterém se molekuly v kapalině začnou shlukovat do malých shluků a uspořádají se tak, aby určily krystalovou strukturu pevné látky. Existují dva typy nukleace:
- Heterogenní nukleace, ke které dochází, když se led začne tvořit kolem místa nukleace, jako je fyzikální porucha, nečistota (např. sůl) v kapalině nebo nepravidelnost v nádobě. Protože biologické vzorky nejsou nikdy čistou vodou, dochází u nich vždy k heterogenní nukleaci.
- Homogenní nukleace, ke které dochází, když se led tvoří bez jakéhokoli předem definovaného místa nukleace. Čistá voda při absenci nukleačních míst zmrzne při teplotě přibližně -39 °C. V praxi se však homogenní nukleace často nevyskytuje, protože zcela čistá voda je vzácná.
Podle přehledu v časopise Cryobiology je „nukleace ledu nejvýznamnější nekontrolovanou proměnnou v konvenční kryokonzervaci, která vede k rozdílům mezi jednotlivými vzorky v obnově, životaschopnosti a funkci buněk“. Autoři doporučují kontrolovat proces nukleace a uvádějí několik metod zmrazování, z nichž mnohé se běžně používají pro aplikace IVF:
- Seeding: Zavedení vnějšího krystalu ledu na podporu nukleace při určité teplotě. Aby se minimalizovalo riziko kontaminace, provádí se nyní seeding vytvořením studeného místa na vnější straně nádoby, například studenými kleštěmi na boku slámy.
- Chemické nukleanty: Ledové nukleační krystaly jsou součástí vzorkovacího média. Chemické nukleanty umožňují širokou standardizaci pro různé typy vzorků a jsou aktivní oblastí výzkumu.
- Elektromrazení: K vyvolání tvorby ledu se používá elektrické napětí.
- Mechanické metody:
- Nárazové chlazení/řízená rychlost zmrazování: Třesení, poklepávání nebo použití ultrazvuku mohou být účinné pro tvorbu jader, ale je obtížné je standardizovat: Vystavení vzorku rychlému nárůstu teploty může podpořit nukleaci. K tomu slouží mrazicí zařízení s řízenou rychlostí, které uvádí vzorky do procesu nukleace.
- Posun tlaku: Nukleaci lze vyvolat zvýšením tlaku na vzorek, snížením teploty a následným uvolněním tlaku.
Vynikající úvod do vlastností tvorby ledu v biologických systémech a další informace o procesu nukleace naleznete v první kapitole zásadního textu „Life in the Frozen State“ z roku 2004, který vřele doporučujeme k přečtení všem, kdo se chtějí o těchto procesech dozvědět více a podrobněji.
.