Funkce dNTP v PCR reakci

dNTP je zkratka pro deoxyribózový nukleotidtrifosfát používaný v PCR k rozšíření rostoucího vlákna DNA. dATP, dTTP, dGTP a dTTP jsou čtyři běžné dNTP používané v PCR.

Funkcí dNTP v PCR je rozšíření rostoucího vlákna DNA pomocí Taq DNA polymerázy. Váže se s komplementárním vláknem DNA pomocí vodíkových vazeb.

PCR je technika syntézy DNA in vitro. Účelem provedení PCR je vytvořit více kopií fragmentů DNA našeho zájmu, abychom je mohli vizualizovat pod gelovou elektroforézou.

Cílem PCR je vytvořit miliony kopií DNA pro různé následné aplikace, jako je sekvenování DNA nebo DNA microarray.

Polymerázová řetězová reakce je bezkonkurenční nástroj používaný v molekulárně genetickém výzkumu od svého objevu. Složkami PCR jsou DNA templát, primery, pufr, Taq DNA polymeráza a dNTP. Abychom pochopili mechanismus PCR, měli bychom se naučit význam každé složky, která se v ní používá,

V tomto článku se zabýváme jednou z klíčových složek PCR, kterou jsou dNTP. Podíváme se také na její strukturu a na to, proč je tak důležitá.

Dále si také povíme o mechanismu interakce dNTPs a Taq DNA polymerázy a jejich působení na rostoucí řetězec DNA.

Dále si povíme o mechanismu, jak spolu dNTPs a DNA polymeráza interagují a pomáhají růst řetězce DNA.

Přečtěte si další články týkající se PCR,

1. Úloha DMSO v PCR: DMSO jako zesilovač PCR
2. Funkce taq DNA polymerázy v PCR
3. Pokyny pro návrh primerů PCR
4. Úloha MgCl2 v reakci PCR

Co jsou dNTP?

DNTP jsou umělé nukleotidy používané v PCR k syntéze nových vláken DNA podobně jako při replikaci DNA. dATP, dTTP, dGTP, dTTP jsou běžné nukleotidy přítomné v mastermixu PCR.

Struktura dNTP:

DNTP znamená deoxyribóza nukleotidtrifosfát.

Pro pochopení dNTP musíme nejprve porozumět několika základním pojmům, jako jsou báze, nukleotidy, nukleosidy, ribonukleotidy, deoxyribonukleotidy, dideoxyribonukleotidy. To jsou některé základní pojmy běžně používané v genetice, přesto je lidé špatně chápou.

Adenin a guanin jsou purinové báze, zatímco cytosin a tymin jsou pyrimidinové báze. Dusíkaté báze nemohou přímo tvořit DNA. K vytvoření molekuly DNA je navíc zapotřebí fosfátová páteř a pentózový cukr.

Nukleotid se skládá z pentózového cukru, fosfátu a dusíkaté báze. Jeden nukleotid se váže s jiným sousedním nukleotidem fosfodiesterovou vazbou, zatímco jeden nukleotid se váže s jiným nukleotidem na opačném vlákně DNA vodíkovou vazbou.

Obrázek představuje strukturu deoxyribózy trifosfátu, difosfátu a monofosfátu.

Přečtěte si další informace o struktuře DNA: Další informace o struktuře DNA: Když není fosfát spojen s nukleotidem (nebo chybí), nazývá se nukleosid (nukleotid bez fosfátu se označuje jako nukleosid).

Když atom vodíku nahradí hydroxylovou skupinu v pentosovém cukru, nazývá se cukr deoxysacharid. DNA je tvořena deoxy pentózovým cukrem, zatímco RNA je tvořena pouze ribózovým cukrem.

DNTP jsou řetězce nukleotidů složené z ribózy, dusíkaté báze a fosfátu.

Dále se ddNTP liší od dNTP.

Dideoxynukleotidtrifosfát nemá volnou 3′ OH skupinu, další 3′ OH skupina cukru je nahrazena vodíkem.

Proto nemůže způsobit rozšíření rostoucího vlákna DNA. Tyto typy ddATP, ddTTP, ddCTP a ddGTP se tedy používají při sekvenování DNA. O úloze ddNTP v sekvenování se podrobněji zmíníme v jiném článku.

DdNTP se používají v metodě terminace řetězce k zastavení expanze syntézy DNA.

Obrázek představuje rozdíl mezi ribózovým cukrem, deoxyribózovým cukrem a deoxyribózovým cukrem.

Trifosfát se skládá ze tří různých molekul fosfátu, které tvoří páteř DNA.

Fosfátová páteř DNA má tři různé molekuly fosfátu, které se nazývají alfa, beta a gama fosfát. Když se uvolní jeden fosfát nebo gama fosfát, struktura se nazývá deoxynukleotid difosfát.

Podobně když se uvolní dva ze tří fosfátů, struktura se nazývá deoxynukleotid monofosfát.

dATP a dGTP jsou puriny, zatímco dCTP a dTTP jsou pyrimidinové dNTP používané v reakci PCR. Funkce dNTP v PCR je stejná jako při replikaci in vivo. Pokud vás zajímají rozdíly mezi nukleotidy a nukleosidy a puriny a pyrimidiny, přečtěte si tyto články:

1. Puriny vs. pyrimidiny
2. Nukleotidy vs. nukleosidy

Obrázek představuje čtyři různé struktury dNTP.

Funkce dNTP:

DNTP jsou složkami PCR, RT-PCR, sekvenování DNA nebo DNA microarray, které pomáhají při růstu DNA nebo amplifikaci DNA.

Mechanismus účinku:

Proces PCR se dělí na tři kroky závislé na teplotě:

1. Denaturace
2. Annealing
3. Extension.

V kroku denaturace se dvouřetězcová DNA denaturuje na jednovláknovou; v kroku žíhání se primer naváže přesně na místo, kde se nachází jeho komplementární sekvence, a,

V kroku extenze přidává Taq DNA polymeráza dNTP na rostoucí vlákno DNA.

Jakmile je vlákno otevřeno a primer se spojí s jednořetězcovou DNA, Taq DNA polymeráza zahájí svou katalytickou činnost.

Taq DNA polymeráza používá jednořetězcovou DNA jako substrát pro enzymatickou činnost a usadí se na spoji primer-DNA.

Jeden konec Taq DNA polymerázy se váže v blízkosti 3′ OH skupiny oligonukleotidového primeru, tento komplex se nazývá P- DNA komplex.

Obrázek představuje strukturu DNA s vodíkovými vazbami a fosfodiesterovou vazbou DNA.

V dalším kroku začalo přidávání dNTP.

DNTP se váže s komplexem P-DNA se slabou afinitou, pokud je přítomen přesný komplementární nukleotid. Brzy poté jej drží Taq DNA polymeráza a dochází k interakci vodíkové vazby mezi komplementární bází a dNTP.

Zde na začátku nerozhoduje celý nukleotid, ale báze (dusíkatá báze) přítomná na dNTP, zda se naváže, nebo ne.

Nejprve, pokud najde komplementární bázi na templátu ssDNA (A pro T a G pro C), vytvoří mezi nimi vodíkové vazby. Vytvoří se tři vodíkové vazby mezi C a G a dvě vodíkové vazby mezi A a T.

Jakmile se vytvoří vodíková vazba, Taq DNA polymeráza přizpůsobí tuto vazbu dNTP s rostoucím vláknem DNA vytvořením fosfodiesterové vazby. Nyní po vytvoření fosfodiesterové vazby se Taq DNA polymeráza posune o krok vpřed pro přidání nového dNTP.

Fosfodiesterová vazba se vytvoří mezi 3′ OH primeru a 5′ P dNTP.

Po vytvoření vodíkové vazby Taq DNA polymeráza katalyzuje reakci odstraněním gama a beta-fosfátu z trifosfátu dNTP. Po dokončení reakce se uvolní dva pyrofosfáty (PPi).

Přesná kinetika interakce dNTP a Taq polymerázy během PCR reakce není dosud známa.

Přečtěte si další informace o elektroforéze v agarózovém gelu,

1. elektroforéze v agarózovém gelu
2. barvivo pro nakládání DNA do gelu
3. Úloha EtBr v elektroforéze v agarózovém gelu

Koncentrace dNTP v PCR:

Všeobecně pro reakci PCR s 30 až 35 cykly běhu postačuje 200 μM každého dNTP.

200μM každého z nich, což znamená, že v jedné reakci PCR se využívá celkem 800μM směsi 4 dNTPs. Pracovní koncentraci si musíme připravit ze zásobního roztoku 100mM.

V posledních dnech jsou však velmi oblíbené a účinné mastermixy připravené k použití. Mastermix připravený k použití obsahuje všechny důležité složky, jako je směs dNTPs, barvivo pro nakládání gelu a Taq DNA polymerázu.

Jako studenti přírodních věd se musíme přiklonit k tomu, jak připravit pracovní roztok ze zásobního roztoku. Předpokládejme, že musíme připravit 2mM pracovní roztok ze 100mM zásoby.

Teď,

Pamatujete si V1C1= V2C2?

Zde je daná koncentrace C1 100mM (což je zásobní koncentrace dNTPs)

V1 je daný objem neznámý (?)

C2 je požadovaná koncentrace = 2mM

V2 je požadovaný objem = 1000μL

Nyní V1C1= V2C2

V1= V2C2/ C1

V1= 1000 * 2/ 100

V1= 20μL

Tady, 20μL každého dNTP potřebného pro přípravu pracovního roztoku, takže konečný objem naší směsi je 80μL (dATP, dCTP, dGTP a dTTP) v 920μL D/W.

Tím získáme konečnou koncentraci 2 mM každého dNTP v 1000 μl pracovního roztoku. Vypočítejte si sami pro 200μM.

Můj konečný návod pro použití dNTP v PCR

Vždy si připravte dvě zkumavky se zásobním roztokem a všechny zkumavky uchovávejte při -20 °C.

Přepočítejte si, kolik reakcí provedete za týden, a podle toho připravte pracovní roztok ze zásobní zkumavky a uchovávejte jej při 4 °C. Protože opakované zmrazování a rozmrazování sníží aktivitu dNTPs.

Při přípravě pracovního roztoku vždy noste žárovky a dodržujte sterilní podmínky, protože kontaminace cizí DNA bude bránit v reakci PCR.

Koncentrace 200 μM je pro reakci PCR dostatečná, avšak pro PCR s dlouhým rozsahem lze použít 2mM až 3 mM koncentrace každého dNTP.

S rostoucí koncentrací dNTP se zvyšuje míra nespecifické vazby. Stejně tak nedostatek dNTP vede k neúplným produktům PCR. Proto vždy používejte přiměřené množství dNTP.

Závěr:

Závěrem lze říci, že funkce dNTPs v reakci PCR je stejně důležitá jako funkce Taq DNA polymerázy.

Pomocí Taq se dNTP vážou s rostoucím vláknem DNA a rozšiřují ho. Pokud si nechcete se všemi těmito věcmi lámat hlavu, můžete použít hotovou sadu PCR, která je výhodnější. Přesto se musíte naučit manuální metodu přípravy činidel.