Frontiers in Oncology

Úvod

Je známo, že přetrvávající infekce vysoce rizikovým lidským papilomavirem (hr-HPV) je nezbytnou příčinou vzniku karcinomu děložního hrdla a prekanceróz (1, 2). Při odhalené etiologii je rakovina děložního čípku vysoce preventabilní (3, 4). Vyspělé země začaly používat testování hr-HPV při primárním screeningu karcinomu děložního hrdla, a to buď samostatně, nebo společně s cytologickým vyšetřením (5-8). Důkazy ukazují, že screeningové programy založené na HPV poskytují větší ochranu před prekancerózou a rakovinou děložního čípku než jiné tradiční screeningové metody, např. cytologie (9-11). Protože však většina HPV infekcí může být spontánně odstraněna, HPV-testování odhalí četné infekce, které nepřejdou v prekancerózu nebo rakovinu děložního čípku, zejména u mladých žen (12). Proto se testování HPV DNA nedoporučuje ke screeningu žen mladších 30 let. U HPV pozitivních pacientek odeslaných k následným zákrokům navíc může dojít ke zbytečným invazivním zákrokům.

V Číně bylo v roce 2015 zaznamenáno 98 900 nových případů a 30 500 úmrtí na rakovinu děložního čípku (13). Aby čínská vláda omezila rostoucí trend výskytu tohoto zhoubného onemocnění, poskytuje od roku 2009 celostátní bezplatný program screeningu karcinomu děložního hrdla pro ženy žijící ve venkovských oblastech, a to pomocí VIA/VILI, Papanicolaouova (Pap) testu nebo HPV testu (v pilotních lokalitách), a to na základě úrovně ekonomického a technologického rozvoje (14). Vzhledem k povaze těchto screeningových metod je však třeba zlepšit diagnostickou přesnost. Vzhledem k velkému počtu obyvatel Číny by navíc měl být vyhodnocen nový screeningový nástroj s vyváženým poměrem mezi citlivostí a specifičností.

Molekulární markery karcinomu děložního hrdla specifické pro dané onemocnění poskytují kombinaci vysoké citlivosti a vysoké specifičnosti pro detekci prekanceróz děložního hrdla. Většina těchto markerů byla identifikována na základě mechanismu karcinogeneze související s HPV. Testování HPV RNA je založeno na detekci mRNA HR-HPV E6 a E7. Onkogenní potenciál HPV infekce závisí na produkci virových onkoproteinů E6/E7. Detekce transkriptů E6/E7 mRNA tak poskytuje možnost specifického testu k detekci prekancerózních lézí.

V této studii jsme hodnotili klinickou účinnost testu HPV E6/E7 mRNA k detekci cervikální intraepiteliální neoplazie (CIN) a karcinomu vysokého stupně u čínských žen.

Materiál a metody

Účastníci a postupy

Tato nemocniční studie byla provedena během dubna až prosince 2017 v čínské provincii Henan. Byly pozvány ženy, které navštívily gynekologické oddělení The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) za účelem kolposkopie. Kritéria pro zařazení do studie byla následující: (1) ženy ve věku 25 až 64 let; (2) bez anamnézy rakoviny děložního čípku nebo hysterektomie; (3) bez klinických příznaků těhotenství nebo 8 týdnů po ukončení těhotenství; a (4) porozuměly postupům studie a dobrovolně se jí zúčastnily. Studie byla schválena Institutional Review Board (IRB) Henan Cancer Hospital (HCH). Od každé účastnice byl získán písemný informovaný souhlas.

Buňky cervikálního exfoliátu byly získány od žen při gynekologickém vyšetření. Vzorek byl uchováván ve 20 ml transportního média PreservCyt® (Hologic Inc., Marlborough, MA, Spojené státy americké) a skladován při 4 °C. Poté bylo gynekologem provedeno kolposkopické vyšetření. Ženy s abnormálním kolposkopickým nálezem podstoupily cílenou biopsii léze. Pokud bylo kolposkopické vyšetření neuspokojivé (skvamokolumnární spojení nebylo zcela viditelné), byla provedena endocervikální kyretáž (ECC). Vzorky exfoliovaných buněk z děložního hrdla byly převezeny do Cancer Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS). Vzorky byly rozděleny na dvě části: 1,5 ml směsi buněk do EP zkumavky pro test HR-HPV DNA a test HPV E6/E7 mRNA. Zbylý preservcyt s exfoliovanými buňkami byl použit pro cytologický test ThinPrep (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, Spojené státy). Pro cytologické vyšetření starším cytologem (15) byl použit systém hlášení Bethesda.

HR-HPV DNA Assay

Vzorky 400 μl buněčné směsi z 1,5 ml EP zkumavek byly použity pro detekci DNA 14 hr-HPV typů (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68) pomocí testu Cobas 4800 HPV (Roche, Basel, SUI). Uvádí souhrnný výsledek pro 14 hrHPV a samostatný výsledek pro HPV 16 a 18 současně (16). Cobas 4800 byl test založený na PCR pro HPV DNA s amplifikací hybridizací nukleových kyselin podle pokynů výrobce. V každém testu byly nastaveny negativní a pozitivní kontroly kvality. Pokud byla hodnota ct větší než 40, byl výsledek považován za negativní. V opačném případě byl výsledek pozitivní. Pozitivní výsledky zahrnovaly tři typy: HPV 16, HPV 18 a HPV ostatní (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68).

Testování HPV E6/E7 mRNA

Pro detekci virové mRNA E6/E7 z typů 14 hr-HPV v souhrnném testu APTIMA HPV (Hologic Inc.) byly použity vzorky o objemu 1,5 ml ze zkumavek EP, Marlborough, MA, Spojené státy americké) podle pokynů výrobce (17). Jednalo se o třístupňový test zahrnující extrakci mRNA, amplifikaci a detekci amplifikovaného produktu. Pokud byl počet kopií větší nebo roven 1,0, byl výsledek považován za pozitivní. V opačném případě byl výsledek negativní.

Histopatologická diagnostika

Biopsie a tkáně ECC byly zaslány do SAHZU k histopatologické diagnostice podle systému hlášení cervikální intraepiteliální neoplazie (CIN). Následně histopatologové z HCH přezkoumali všechny preparáty. Jakákoli nesouhlasná patologická diagnóza byla zaslána do CICAMS k posouzení. Konečná diagnóza u každé ženy byla stanovena na základě nejhoršího výsledku hodnocení panelu. Celý proces detekce a diagnostiky byl slepý.

Statistická analýza

Konečná histopatologická diagnóza byla použita jako zlatý standard. Ženy s TCT diagnózou dlaždicové intraepiteliální léze nízkého stupně (LSIL) nebo horší (LSIL +) byly považovány za pozitivní cytologii na bázi tekutiny (LBC). Výsledky HPV DNA byly stratifikovány podle typů HPV: HPV16/18 (tj. HPV16 a/nebo HPV18 pozitivní), HPV-ostatní (tj. kterýkoli z 12 hr-HPV typů pozitivní s výjimkou HPV16 a HPV18) a HPV-celkem (tj. kterýkoli ze 14 hr-HPV typů pozitivní). Byly vypočteny absolutní odhady a 95% konfidenční intervaly (95%CI) pozitivity, senzitivity, specificity, pozitivní prediktivní hodnoty (PPV) a negativní prediktivní hodnoty (NPV). Rozdíly v expresi HPV mRNA v různých skupinách HPV byly vypočteny pomocí chí-kvadrát testu nebo Fisherova exaktního testu. McNemarův test byl použit ke zjištění rozdílů v citlivosti a specifičnosti. Hladina α byla stanovena na 0,05 a p < 0,05 (dvouvelikost) bylo považováno za statisticky významné.

Výsledky

Do této analýzy bylo zahrnuto celkem 537 žen. Průměrný věk byl 43,88 ± 10,97 let. Diagnózy LBC byly následující: 183 (34,7 %) normálních, 135 (25,1 %) atypických dlaždicových buněk neurčitého významu (ASC-US), 22 (4,1 %) atypických dlaždicových buněk nelze vyloučit HSIL (ASC-H), 7 (1.3 %) atypických žlázových buněk (AGC), 82 (15,3 %) LSIL, 75 (14,0 %) dlaždicových intraepiteliálních lézí vysokého stupně (HSIL), 31 (5,8 %) dlaždicobuněčných karcinomů (SCC) a 2 (0,4 %) adenokarcinomů in situ (AIS). Histopatologické diagnózy byly následující: 298 (55,5 %) normální, 30 (5,6 %) cervikální intraepiteliální neoplazie 1. stupně (CIN1), 48 (8,9 %) CIN2, 111 (20,7 %) CIN3, 43 (8,0 %) SCC a 7 (1,3 %) AIS.

Tabulka 1 ukazuje korelaci mezi detekcí mRNA a DNA podle typů HPV. Celková shoda obou testů byla 90,7 % (95%CI: 87,9, 92,9) s hodnotou kappa 0,81. Míra pozitivity mRNA byla 91,7 %, 84,6 % a 86,4 % u HPV16/18, HPV-ostatní a HPV-celkem pozitivních žen. Všechny míry pozitivity mRNA byly vyšší u HPV-pozitivních žen než u HPV-negativních žen ve stejné skupině HPV typů (všechny p < 0,001).

Pozitivita HPV DNA, mRNA a LBC se zvyšovala se závažností histopatologické diagnózy, pohybovala se od 25,5 %, 19,1 % a 11,4 % u normálního stavu po 100,0 % u SCC. U AIS byla pozitivita těchto tří testů 85,7 %, 85,7 % a 100,0 %. Tyto tři testy měly podobnou míru pozitivity u CIN3, SCC a AIS. U žen s diagnózou CIN2 však byla míra pozitivity mRNA relativně nižší. Míra pozitivity HPV16 byla ve srovnání s ostatními skupinami HPV DNA nejvyšší u CIN3, SCC a AIS. Míra pozitivity HPV18 byla nižší než 7 % u všech dlaždicobuněčných lézí, ale o něco vyšší (28,6 %) u AIS (tabulka 2).

Tabulka 3 ukazuje klinickou výkonnost tří testů při detekci lézí CIN2+ a CIN3+. Senzitivita mRNA pro detekci CIN2+ a CIN3+ byla 93,8 % (95%CI: 89,7-96,4), resp. 95,7 % (95%CI: 91,3-97,9), což se nelišilo od citlivosti detekce pomocí DNA (95,7 % pro CIN2+, 96,3 % pro CIN3+), ale byla vyšší než citlivost detekce pomocí LBC (80,4 % pro CIN2+ a 88,8 % pro CIN3+). Specificita mRNA pro detekci CIN2+ (79,0 % ) a CIN3+ (70,5 % ) byla významně vyšší než specificita detekovaná pomocí DNA (71,0 % pro CIN2+, 62,8 % pro CIN3+) (p < 0,05), ale nižší než specificita detekovaná pomocí LBC (84,5 % pro CIN2+, 79,8 % pro CIN3+). PPV pro mRNA k detekci CIN2+ a CIN3+ byly 74,0 % (95%CI: 68,4-78,9) a 58,1 % (95%CI: 52,1-63,9) a NPV byly 95,2 % (95%CI: 92,0-97,2) a 97,4 % (95%CI: 94,8-98,8).

Tabulky 4, 5 ukazují míru pozitivity a klinickou výkonnost tří testů v různých věkových skupinách. Souhrnně lze říci, že všechny testy vykazovaly lepší výkonnost u žen starších 30 let než u žen mladších. Test HPV DNA měl nejvyšší citlivost a LBC měl nejvyšší specificitu pro detekci CIN2+ a CIN3+ u žen mladších než 30 let.

Diskuse

Prezentované výsledky ukázaly, že mRNA test a DNA teat dosáhly vysoké shody jako 90,7 %. Míra pozitivity HPV DNA, mRNA a LBC se zvyšovala se závažností histopatologické diagnózy, a to od 25,5 %, 19,1 % a 11,4 % u normálního stavu až po 100,0 % u SCC. Senzitivita mRNA pro detekci CIN2 a CIN3+ byla 93,8 % a 95,7 %, což bylo podobné jako u detekce pomocí DNA (95,7 % pro CIN2+ a 96,3 % pro CIN3+). Specifičnost pro mRNA (79,0 % pro CIN2+ a 70,5 % pro CIN3+) však byla výrazně vyšší než specifičnost zjištěná pomocí DNA (71,0 % pro CIN2+ a 62,8 % pro CIN3+).

V této studii vykazoval test HPV E6/E7 mRNA a test HPV DNA vysokou shodu. Z těch žen, které byly pozitivní na HPV 16/18 DNA, bylo 91,7 % pozitivních také na mRNA, což je podobné jako v jiných studiích, které uvádějí celkovou shodu více než 90 % mezi testem APTIMA HPV a testy HPV DNA (17, 18) a konzistentně vyšší míru pozitivity testu HPV DNA v různých populacích (19, 20). Zaznamenali jsme vyšší míru pozitivity u starších žen než u žen mladších, což se mírně liší od jiných studií (21-23). Tuto odchylku lze přičíst designu studie (tj. nemocniční studie), který omezuje extrapolaci výsledků na obecnou populaci. Zajímavé je, že míra diskordance byla vyšší u žen ve věku 30 let a mladších (25,6 % oproti 8,6 %). Studie prokázaly vyšší míru spontánní clearance HPV infekce u mladších žen, což naznačovalo nižší možnost integrace HPV (24).

Jak víme, testy HPV založené na DNA detekují přítomnost nebo nepřítomnost HPV DNA. Většina HPV infekcí je však přechodná, spontánně vymizí do 1 roku a nedojde tak k progresi do prekancerózy nebo karcinomu děložního hrdla (25). Exprese mRNA E6/E7 se vyskytuje pouze v aktivně infikovaných buňkách a zvyšuje se během vývoje a progrese CIN (26). Proto se předpokládá, že HPV mRNA test je specifičtější při detekci cervikálních lézí vysokého stupně. Naše údaje tuto hypotézu potvrdily. Zjistili jsme, že test mRNA byl stejně citlivý jako test DNA, ale specifičtější při detekci prekanceróz děložního hrdla a karcinomu. Jiní výzkumníci dospěli k podobným závěrům buď při primárním screeningu (20), nebo při třídění žen s méně abnormální cytologií (27). V naší studii mělo 50 žen nesouhlasné výsledky mezi HPV DNA a mRNA testem. Z nich 34 DNA + /mRNA- versus 8 mRNA + /DNA- bylo diagnostikováno jako normální nebo CIN1; 6 versus 2 byly diagnostikovány jako CIN2 nebo CIN3; u rakoviny nebyl pozorován žádný rozdíl v testech. Pokud bychom tedy nahradili test HPV DNA testem mRNA, 34 žen by nebylo odesláno na zbytečnou kolposkopii, ale 4 CIN2 a 2 CIN3 by byly přehlédnuty. I přes vynechání 6 případů nedošlo ke ztrátě senzitivity, ale zvýšila se specificita. Literatura uvádí, že 40-60 % případů CIN2 by do 2 let regredovalo (28, 29) a ne všechny případy CIN3 jsou skutečné přednádorové léze (30). Cook a kol. rovněž zjistili nízkou míru výskytu CIN2+ u žen s mRNA-/DNA+ (17). Proto bylo riziko invazivního karcinomu u 6 žen v krátkém časovém intervalu nízké.

Vyhodnotili jsme také účinnost testu u starších a mladších žen. Věkově specifická analýza zjistila, že všechny tři testy fungovaly lépe u žen starších 30 let. Na základě skutečnosti, že mladší ženy s lézemi CIN měly vyšší možnost regrese, navrhujeme konzervativní postup u mladších žen. Studie zjistily, že HPV infekce byla u mladých žen častá, nicméně velká část z nich byla přechodná a mohla se spontánně vyčistit (31, 32). Krátké trvání většiny HPV infekcí u těchto žen naznačuje, že související cervikální dysplazie by měla být řešena konzervativně (12). Test HPV DNA proto nemusí být vhodnou screeningovou metodou pro ženy mladší 30 let, a to z důvodu vysoké míry falešně pozitivních výsledků. Měla by být vyhodnocena screeningová účinnost cytologie a E6/E7 mRNA komplexně u mladých žen. V naší studii údaje ukázaly, že cytologie má nejvyšší specificitu u žen mladších 30 let, ale citlivost je nižší než u testu HPV DNA. V případě E6/E7 mRNA však měla u žen mladších 30 let střední výkonnost, která byla vyšší než citlivost cytologie a zároveň vyšší specificita než u HPV DNA, což naznačuje, že testování E6/E7 mRNA může být slibnou možností pro screening žen mladších 30 let.

Přestože čínský Úřad pro kontrolu potravin a léčiv schválil tři profylaktické vakcíny proti HPV (tj. Cervarix, Gardasil a Cecolin), prevence rakoviny děložního čípku stále spočívá ve screeningu. V roce 2009 čínská vláda zahájila celostátní bezplatný screening rakoviny děložního čípku pro venkovské ženy. V roce 2015 byl v pilotních místech poprvé použit test HPV DNA jako primární screeningový nástroj. Vzhledem k velkému počtu obyvatel by však screening založený na testu HPV DNA vedl k nevyhnutelným obrovským falešně pozitivním výsledkům, což by vedlo k plýtvání zdravotnickými zdroji a zbytečným obavám. Je slibné, že mRNA by mohla být použita v národním programu screeningu rakoviny děložního čípku, aby se snížila falešná pozitivita bez ztráty citlivosti.

V této studii je třeba se zabývat několika omezeními. Zaprvé se jedná o průřezovou studii a nemohli jsme vyhodnotit riziko progrese léze spojené s mRNA HPV E6/E7. Naše data jsme však stratifikovali podle histologického stupně, což poskytuje informace o korelaci. Za druhé je důležité poznamenat, že výsledky nelze plně zobecnit na obecnou populaci, protože účastníci studie byli rekrutováni z ambulantních pacientů v nemocnici.

Závěrem lze říci, že test APTIMA mRNA měl dobrou shodu s testem Cobas 4800 HPV DNA s podobnou senzitivitou a vyšší specificitou pro detekci cervikálních lézí vysokého stupně. Je slibné, že mRNA by mohla být použita v čínském národním programu screeningu karcinomu děložního hrdla ke snížení falešné pozitivity bez ztráty citlivosti. K vyhodnocení klinické účinnosti testu mRNA u mladších žen v Číně jsou zapotřebí další studie.

Vyjádření o dostupnosti dat

Všechny soubory dat vytvořené pro tuto studii jsou součástí článku/doplňkového materiálu.

Etické vyjádření

Studie zahrnující lidské účastníky byly přezkoumány a schváleny role koexprese HPV E6/E7 mRNA a proteinu p16/Ki-67 v predikci rizika vzniku karcinomu děložního hrdla. Etickou komisí pro posuzování životních věd na univerzitě v Čeng-čou. Pacientky/účastnice poskytly písemný informovaný souhlas s účastí v této studii.

Příspěvky autorů

S-KZ přispěl k návrhu a napsal rukopis. ZG přispěl k napsání a revizi rukopisu. PW, M-MJ a P-PG přispěli k vyšetřování a testu HPV DNA. L-NK a Z-NW přispěli k vyšetření HPV mRNA. D-MZ přispěl k cytologickému a histologickému vyšetření. QC a X-QC provedli statistickou analýzu. X-BS se podílel na koncepci studie a pomáhal se statistickými analýzami. Y-LQ a J-GZ se podíleli na koncepci studie a pomáhali při psaní rukopisu. J-GZ pomáhal při provádění studie. Všichni autoři přečetli a schválili konečný rukopis.

Financování

Tato práce byla podpořena National Natural Science Foundation of China (grant č. 81502475) a Science and Technology Project of Henan Province (grant č. 172102310067).

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že výzkum byl prováděn bez jakýchkoli komerčních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

Poděkování

Všem ženám zapojeným do této studie děkujeme za jejich účast. Oceňujeme také příspěvek všech příslušných lékařů pro tuto studii a pomoc Národního onkologického centra, Onkologické nemocnice, Čínské akademie lékařských věd a Peking Union Medical College. Rovněž jsme ocenili 32. mezinárodní konferenci o papilomavirech (IPVC 2018) za poskytnutí platformy k prezentaci abstraktu této studie (název: Clinical Performance of HPV E6/E7 mRNA test to Detect Cervical High-grade Intraepithelial Neoplasia and Cancer: (IPVC8-0744 Poster Session).

Zkratky

hr-HPV, vysoce rizikový lidský papilomavirus; VIA/VILI, vizuální kontrola kyselinou octovou/vizuální kontrola Lugolovým jodovým roztokem; Pap, papanicolaou; SAHZU, Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95%CI, 95% konfidenční intervaly; ECC, endocervikální kyretáž; TCT, cytologický test ThinPrep; CIN, cervikální intraepiteliální neoplazie; LSIL, dlaždicová intraepiteliální léze nízkého stupně; HSIL, dlaždicová intraepiteliální léze vysokého stupně; LBC, cytologie na bázi tekutiny; PPV, pozitivní prediktivní hodnota; NPV, negativní prediktivní hodnota; ASC-US, atypické dlaždicové buňky neurčitého významu; ASC-H, atypické dlaždicové buňky nelze vyloučit HSIL; AGC, atypické žlázové buňky; SCC, dlaždicobuněčné karcinomy; AIS, adenokarcinom in situ.

.