Bookshelf

Mnoho enzymů zapojených do biogeneze peptidů bylo identifikováno

Nejčastější kroky při zpracování prekurzorů a zapojené enzymy jsou znázorněny na obrázku 18-5. Zapojenými endoproteázami jsou prohormonální konvertasy 1 a 2 (PC1 a PC2), exopeptidasou je karboxypeptidasa E (CPE, nazývaná také CPH a enkefalin konvertasa) a α-amidujícím enzymem je peptidylglycin α-amidující monooxygenasa (PAM). Mnoho kroků v jejich biosyntéze není jedinečných pro neuropeptidy, jako je štěpení signálních peptidů, tvorba disulfidových vazeb, přidávání a následná modifikace N- a O-vázaných oligosacharidů, fosforylace a sulfatace. Jak je znázorněno na obrázku 18-3, k mnoha posttranslačním krokům dochází, když zrající neuropeptidy putují axonem směrem k synapsím v LDCV. Pozdější kroky biosyntézy neuropeptidů (obr. 18-5) jsou jedinečné pro neurony a endokrinní buňky.

Klíčové enzymy v biosyntéze neuropeptidů zahrnují endoproteázy, exoproteázy a enzymy modifikující konce peptidů. Objev a charakterizace Kex2p, endoproteázy, která štěpí kvasinkový pro-α-mating faktor za vzniku čtyř kopií feromonového α-mating faktoru (obr. 18-2), byly klíčové pro objev savčích prohormonových konvertas, včetně furinu, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC a PACE4 . Prohormonální konvertasy sdílejí homologii s bakteriálními subtilisiny a mají katalytickou triádu Asp-His-Ser, která se skládá ze tří klíčových aminokyselin zapojených do katalýzy (na obr. 18-5 označeny D, H a S). Proregion každé z nich (obr. 18-5) musí být přítomen během biosyntézy, aby se proteáza správně složila, ale musí být odstraněn, aby vznikla aktivovaná proteáza. U PC1 a furinu dochází k odstranění proregionu během několika minut biosyntézy, zatímco je enzym v endoplazmatickém retikulu, a jedná se pravděpodobně o autokatalytickou událost. U ostatních prohormonálních konvertas je odstranění proregionu mnohem pomalejší. Exprese aktivního PC2 vyžaduje koexpresi peptidu 7B2 (obr. 18-5), který zřejmě plní funkci chaperonu a může také zabránit expresi endoproteolytické aktivity PC2, dokud není PC2 uložen v sekrečních granulích. Pro ostatní prohormonální konvertasy nebyl identifikován žádný odpovídající chaperon/inhibitor peptid.

Savčí endoproteasy, které se nejzřetelněji podílejí na zpracování neuropeptidů, jsou PC1 a PC2, Ca2+-dependentní proteasy nacházející se v sekrečních granulích, jejichž exprese je omezena na neurony a endokrinní buňky (obr. 18-5). Několik dalších členů této rodiny endoproteáz je exprimováno šířeji, zatímco další jsou exprimovány na omezených místech odlišných od neuronů a endokrinních buněk. Například furin se vyskytuje prakticky ve všech buňkách a je lokalizován především v trans-Golgiho síti; furin katalyzuje štěpení důležité pro funkci peptidů, jako je počáteční štěpení prekurzorů ELH, nervového růstového faktoru a parathormonu, a také štěpení v prekurzoru inzulinového receptoru za vzniku aktivní formy αβ dimeru receptoru. Furin se může podílet také na aktivaci některých dalších zpracovatelských enzymů, jako jsou PC2 a CPE.

PC1 a PC2 štěpí vybrané páry základních aminokyselin v peptidových prekurzorech: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys a Arg-Lys. PC1 může také katalyzovat štěpení na vybraných místech s jedním Arg přítomným v některých prekurzorech, jako je prosomatostatin a procholecystokinin. Štěpení v LDCV pomocí PC je přísně kontrolováno a často probíhá velmi uspořádaně (obr. 18-6). K počátečnímu štěpení POMC dochází za méně než 1 h (obr. 18-6, kroky 1 a 2), zatímco k dalším štěpením dochází až po několika hodinách (obr. 18-6, kroky 6 a 7). Endoproteolytické štěpení propeptidů je často rychlost limitující reakcí při biosyntetickém zpracování peptidů.

Vzorce štěpení katalyzované PC1, PC2 a furinem při expresi v neuronech a endokrinních buňkách je mnohem selektivnější než vzorce štěpení pozorované ve zkumavkových testech s purifikovanými enzymy. Například ačkoli prohormonální konvertasy obvykle štěpí na COOH-konci dvojice bazických zbytků v modelových peptidových substrátech, v buňkách mohou být štěpení uprostřed dvojice bazických zbytků, jako v případě štěpení POMC (obr. 18-6), kde jsou bazické zbytky odděleny a zůstávají se dvěma výslednými zralými peptidy . Je pravděpodobné, že koncentrace Ca2+ a vnitřní pH LDCV jsou dvě proměnné, které neurony a endokrinní buňky používají k regulaci endoproteolytické aktivity v LDCV

Může se ukázat, že v biosyntéze neuropeptidů hrají roli i další endoproteázy. Hlavními kandidáty jsou savčí homolog kvasinkové aspartylové proteázy-3 (YAP-3) a N-arginin dibasová (NRD) konvertáza . Další zvrat v biosyntéze peptidů je patrný v srdci, kde je proatriální natriuretický faktor (proANF) skladován v LDCV a přesto je zralý ANF uvolňován z buněk síní do oběhu. Na zpracování proANF, které zahrnuje štěpení po jediném zbytku Arg v proANF, se nemůže podílet PC1 nebo PC2, protože těchto PC je v srdci zanedbatelné množství.

CPE je rozpustný protein, který se nachází prakticky ve všech LDCV v neuronech a endokrinních buňkách (obr. 18-5) . Odstraňuje základní zbytky, Lys nebo Arg, z COOH konců peptidových meziproduktů produkovaných prohormonovými konvertasami. Původně byl identifikován podle své tkáňové distribuce a substrátové specifity spolu se specifickou inhibicí kyselinou guanidinoethylmerkaptosukcinovou (GEMSA). CPE je enzym aktivovaný Co2+ a Zn2+ s krátkým proregionem, který je obvykle odstraněn během zrání enzymu; na rozdíl od prohormonálních konvertas je CPE aktivní s připojeným proregionem. Karboxypeptidázová funkce zpracování peptidů obvykle neomezuje rychlost, protože peptidové meziprodukty s COOH-koncovými bazickými zbytky jsou v extraktech tkání nebo LDCV detekovány pouze v extrémně nízkých koncentracích. Nedávno byly identifikovány další karboxypeptidázy, zejména CPD, integrální membránová forma enzymu se třemi karboxypeptidázovými doménami. Relativní význam CPE a těchto dalších karboxypeptidáz pro zpracování neuropeptidů in vivo není jasný. Vzhledem k tomu, že štěpení na dvojici bazických zbytků může být uprostřed dvojice, existuje dobrý důvod se domnívat, že se v LDCV bude nacházet aminopeptidáza.

PAM je bifunkční enzym, který se nachází téměř ve všech LDCV (obr. 18-5) . PAM působí na peptidové substráty po endoproteolytickém štěpení a působení exopeptidázy, kdy je obnažen COOH-koncový zbytek Gly, a přeměňuje peptidyl-Gly na odpovídající peptid-NH2. Přibližně polovina známých bioaktivních peptidů je α-amidovaná a α-amidace je obecně rozhodující pro biologickou účinnost. Formy peptidyl-Gly a peptid-COOH jsou ve fyziologických koncentracích obvykle neaktivní. První krok α-amidační reakce provádí peptidylglycin α-hydroxylační monooxygenáza (PHM), která je NH2-koncovou částí bifunkčního proteinu PAM. PHM váže dva atomy Cu2+ , které se účastní katalýzy tím, že procházejí cykly redukce a oxidace. PHM používá jako redukční činidlo kyselinu askorbovou, přičemž jeden atom kyslíku z O2 se inkorporuje do peptidu během hydroxylačního kroku. PHM je tedy enzymaticky velmi podobná dopamin β-monooxygenáze (DBM), která přeměňuje dopamin na noradrenalin (viz kap. 12). Druhý krok α-amidační reakce provádí druhá enzymatická doména PAM, peptidyl-α-hydroxyglycin α-amidující lyasa (PAL). Doména PAL představuje nový enzym závislý na iontech dvojmocných kovů. Neurony primárně exprimují integrální membránovou formu bifunkčního proteinu PAM (obr. 18-5), zatímco dodatečné štěpení mRNA umožňuje některým endokrinním buňkám exprimovat rozpustnou verzi proteinu bez transmembránové domény. U integrálních membránových forem PAM zasahuje krátká COOH-koncová doména do cytoplazmy a podílí se na směrování PAM mezi LDCV a povrchem buňky. Zásobu redukovaného askorbátu v LDCV udržuje cytochrom B561, protein, který má pět transmembránových domén a přenáší elektrony z cytosolového askorbátu na askorbát v lumen LDCV . Cytochrom B561 se nachází také ve vezikulech obsahujících katecholamin, kde plní podobnou funkci pro DBM (viz kap. 12). Nervové a endokrinní tkáně udržují koncentrace redukovaného askorbátu přibližně 100krát vyšší než koncentrace askorbátu v krvi, zatímco většina ostatních tkání askorbát nekoncentruje.

Několik peptidů má NH2-koncové zbytky kyseliny pyroglutamové, označované také jako cyklická kyselina glutamová (<Glu), které jsou nezbytné pro bioaktivitu, například hormon uvolňující tyreotropin (TRH) a hormon uvolňující gonadotropin (GnRH). Enzymem odpovědným za tento krok je glutaminylcykláza, která přeměňuje původní NH2-koncový Gln na <Glu. Regulace a funkce glutaminylcyklázy nebyla dosud důkladně prozkoumána. Další důležitou, ale málo častou modifikací peptidů je α-N-acetylace (obr. 18-6 a 18-7). Během zpracování POMC α-N-acetylace výrazně zvyšuje účinnost ACTH(1-13)NH2 na tmavnutí kůže a zároveň ruší jak adrenální steroidogenní účinnost ACTH, tak opiátovou aktivitu β-endorfinu . Enzym(y) zodpovědný(é) za tuto modifikaci nebyl(y) dosud purifikován(y) ani klonován(y).

Příklad na obrázku 18-6 je znázorněn vzorec kroků zpracování v systému POMC . Počáteční endoproteolytické kroky (obr. 18-6, kroky 1-4) jsou zprostředkovány PC1 a vyskytují se ve všech neuronech a endokrinních buňkách produkujících POMC, obvykle v uvedeném číselném pořadí. Je zřejmé, že kroky 1 a 2 jsou iniciovány v trans-Golgiho síti a pokračují v LDCV, zatímco krok 4 se vyskytuje pouze v LDCV. Kroky 5-7 se vyskytují pouze v LDCV a zdá se, že vyžadují PC2. V dospělé přední hypofýze obsahují kortikotropy PC1, ale nikoliv PC2, a provádějí pouze štěpení 1-4. Během časného postnatálního vývoje však kortikotropy exprimují také PC2 a štěpení 5-7 je přechodně pozorováno v kortikotropech. U potkana exprese PC2 a štěpení v rámci ACTH (štěpení 5) klesá současně několik týdnů po narození, přibližně v době, kdy se objevuje dospělý vzorec kontroly ACTH nad steroidogenezí nadledvin.

Melanotropy a neurony CNS tvořící POMC exprimují PC1 i PC2, a proto jsou v těchto buňkách vidět menší peptidové produkty. PAM je exprimován ve všech buňkách produkujících POMC, takže α-amidace spojovacího peptidu (JP), malého peptidu bez jasné biologické funkce, probíhá rychle ve všech buňkách POMC (obr. 18-6). V melanotropech intermediární hypofýzy a POMC neuronech jádra solitárního traktu dochází k α-N-acetylaci ACTH(1-13)NH2 a β-endorfinu. V melanotropech může dojít k α-N-acetylaci ACTH před štěpením 5. Jak je uvedeno na obrázku 18-4, konkrétní provedené štěpení a modifikace NH2- a COOH-konců peptidových produktů určují směs uvolněných bioaktivních peptidů

.