Kondenzor – různé typy. Kontrast v mikroskopu
V předchozím článku o okuláru jsem upozornil, že okulár je obvykle umístěn tak, aby jeho přední ohnisková rovina byla v souběhu s primární obrazovou rovinou (PIP). PIP je konjugovaná se vzorkem v zobrazovací soustavě konjugovaných rovin, a je tedy užitečná pro měření vlastností mikroskopických vzorků.
Stejným způsobem je přední ohnisková rovina kondenzoru konjugovaná se zadní ohniskovou rovinou objektivu (ale ne se vzorkem) v osvětlovací soustavě paprsků. Kondenzátor tedy poskytuje přístupné místo, kde můžeme měnit nebo regulovat kontrast obrazu manipulací s osvětlovacími paprsky světla. Tyto dva principy vyplývají z Köhlerovy osvětlovací metody, kterou jsme se zabývali ve 3. části tohoto seriálu.
Funkce kondenzoru
Kondenzor plní v mikroskopu dvě funkce. Zajišťuje plochu rovnoměrně osvětleného světla v zorném poli v rovině vzorku a rovnoměrně osvětluje aperturu objektivu světlem s dostatečným a přitom kontrolovatelným úhlem. Za druhé, jak bylo uvedeno výše, poskytuje prostředek k regulaci kontrastu (Bradbury & Evennett, 1996). Nejjednodušší formou kondenzátoru je konkávní zrcadlo, které však není užitečné pro objektivy s hodnotou NA vyšší než 0,2 nebo vyšší. Pokud je váš mikroskop vybaven zrcadlem a vzdáleným zdrojem světla, musí být plochá strana zrcadla použita ve spojení s jakýmkoli namontovaným podstropním kondenzátorem. Je to proto, že přísně vzato by měl kondenzor přijímat paralelní osvětlení a tím toto světlo přivádět do ohniska v zadní ohniskové rovině kondenzoru (kde se nachází vzorek).
Typy kondenzorů
Nejpoužívanějším typem kondenzoru je Abbeho kondenzor pro mikroskopii v jasném poli (obrázek 1a, 1b). Je konstruován ze dvou nebo tří čoček a horní čočku s krátkým ohniskem lze obvykle vyklopit z optické dráhy (1a) nebo odšroubovat (1b), aby bylo možné vyplnit zorné pole objektivy s malým výkonem. Tento jednoduchý osvětlovač postačí pro většinu typů mikroskopie. Původně byl navržen tak, aby poskytoval úzké paprsky (nebo „tužky“) šikmého světla z excentricky umístěné clony v přední ohniskové rovině kondenzoru. Obrázek 1c ukazuje jednoduchý Abbeho osvětlovač se dvěma čočkami namontovaný na podstropním přístroji, který lze otáčet a excentricky posouvat, aby poskytoval šikmé osvětlení. Obrázek 1d ukazuje kondenzor s malým výkonem určený k úplnému vyplnění velkého zorného pole objektivů s velmi malým zvětšením.
Ačkoli může být pro kondenzor uvedena numerická apertura (často 0,9 NA u suchých kondenzorů a maximálně 1,4 NA u olejových imerzních typů), tyto údaje neuvádějí NA, pro kterou jsou osvětlovací paprsky korigovány na sférickou aberaci. V mnoha jednoduchých kondenzátorech je pevný světelný kužel pro axiální osvětlení zřídka korigován na sférickou aberaci nad 0,45 NA. Pro vysoce kvalitní práci a pro rozlišení struktury na hranici rozlišovací schopnosti musí být kondenzory korigovány na aberaci. Plně korigované kondenzátory, stejně jako objektivy, obsahují mnoho čoček a mohou být korigovány téměř ve stejném rozsahu. Achromaticko-aplanatický kondenzor (1e) je korigován jak na sférickou, tak na chromatickou aberaci a měl by se používat pro práci nejvyšší kvality a pro barevnou mikrofotografii. Aplanatické kondenzátory jsou korigovány pouze na sférickou aberaci.
Tzv. univerzální kondenzátory (obr. 2) jsou multifunkční. Skládají se z otočného disku, na kterém je umístěn výběr clon, filtrů, patch stopů, fázových destiček nebo Wollastonových hranolů pro diferenciální interferenční kontrast (DIC). Toto uspořádání umožňuje pohodlně a snadno přecházet z jedné kontrastní metody na druhou. Tmavozelená zástěrka obvykle funguje pouze do hodnoty NA 0,5 nebo nižší. Pro použití s objektivy s vyšší NA je třeba použít speciálně zkonstruovaný kondenzor s tmavým terénem (obrázek 3). Podrobnosti o jeho použití a dalších metodách zvyšování kontrastu viz Bradbury & Evennett (1996).
Obrázek 2. Univerzální kondenzátory. Na prostředním obrázku je sejmutý horní kryt, který zobrazuje otočný disk, na němž jsou umístěny fázové anály apertury, DIC hranoly, temnozemní patkové zarážky, Rheinbergovy disky a Hoffmanovy modulační filtry. Většina univerzálních kondenzorů disponuje aperturní clonou pro práci v jasném poli, několika anulami pro fázový kontrast a temnozemní zarážkou pro nízkovýkonný temnozem.
Obrázek 3. Kondenzátory tmavého základu. 3(a) Suchý kondenzátor temného základu. 3(b) & 3(c) Olejové kondenzátory s tmavým zemněním. 3(d) Nastavitelný olejový kondenzátor tmavého pozadí; tento kondenzátor lze nastavit tak, aby vyhovoval různým tloušťkám sklíček a poskytoval vysoce kvalitní obraz tmavého pozadí.
Mikroskopie v procházejícím a odraženém světle
Uspořádání mikroskopu v procházejícím světle vyžaduje samostatný kondenzor, protože světlo je nejprve kondenzováno na vzorku (kde světlo interaguje s hmotou) a poté je zachyceno objektivem dále podél optické osy.
U mikroskopu v odraženém světle je situace jiná. Zde je dráha paprsku složena kolem osy vzorku, kde se světlo odráží od jeho povrchu. Objektiv funguje jako vlastní kondenzor a seřízení mikroskopu s odraženým světlem je velmi zjednodušeno (viz paprskové diagramy ve 2. části tohoto seriálu). Je však obtížné dosáhnout zadní ohniskové roviny objektivu (přední ohniskové roviny při použití jako kondenzoru), proto se používají doplňkové čočky, které vytvářejí polohu, při níž je obraz clon a filtrů konjugován se zadní ohniskovou rovinou.
Systém s dopadajícím světlem je velmi užitečný pro fluorescenční mikroskopii, především proto, že osvětlení vzorku je jednoduché, je účinnější (poskytuje jasnější obrazy při velkých zvětšeních) a je umožněna kombinace s dalšími kontrastními metodami pomocí procházejícího světla.
Obrázek 4: Systém s dopadajícím světlem. Ilustrace epiluminátoru pro mikroskopii v odraženém světle
Tento epiluminátor má dva typy objektivů v odraženém světle, které jsou upevněny v jeho nástavci. Používaný objektiv je určen pro osvětlení tmavého terénu, zatímco další dva objektivy, které lze vidět, pro práci v jasném poli v odraženém světle. Široké nákružky kolem těchto dvou objektivů umožňují vycentrování objektivu na optickou osu. Písmeno „D“ na krytu epi-iluminátoru označuje výměnnou vložku, která umožňuje použití přístroje pro osvětlení tmavého pole. Lze ji vyměnit za rovinné zrcadlo pro mikroskopii v jasném poli s odraženým světlem. Kondenzátor v procházejícím světle byl zespodu stolku odstraněn.
Pokud objektiv funguje jako vlastní kondenzor v mikroskopii v odraženém světle, proč se objektivy nepoužívají také pro osvětlení v mikroskopii v procházejícím světle? Kromě praktických potíží s přístupem k zadní ohniskové rovině objektivu je obtížné využívat objektivy víceúčelově a úhel osvětlení není obvykle regulovatelný (clonou v zadní ohniskové rovině objektivu).
Základní principy zvyšování kontrastu
Dostatečná viditelnost neboli kontrast je nutný k tomu, abychom mohli vnímat detaily v obraze, který je rozlišován našimi mikroskopy. Důležitá je selektivita: k rozeznání detailů potřebujeme alespoň určité regionální rozdíly uvnitř objektu a mezi objektem a pozadím.
Kontrast v obraze se získává třemi způsoby, a to buď samostatně, nebo v kombinaci. Jsou to:
- interakce mezi vzorkem a světlem,
- manipulace s osvětlením a
- manipulace s médiem pro záznam obrazu.
Změny kontrastu v části c) lze dosáhnout vyvoláním fotografie a/nebo tiskem a také pomocí elektronického kontrastu analogového videa nebo digitálního obrazu. Kondenzátor je však v částech (a) a (b) nástrojem pro manipulaci s kontrastem a viditelností obrazu. Další podrobnosti o teoretických a praktických aspektech kontrastních technik ve světelné mikroskopii lze nalézt v Bradbury & Evennett, 1996 a Sanderson, 2002, 2000, 1998 a 1994. Stručně řečeno, nejznámějšími formami vytváření kontrastu jsou světlé pole, šikmé osvětlení, tmavý terén & Rheinberg, fázový kontrast a DIC. Tyto metody je také možné kombinovat s různými formami osvětlení (např. polarizované světlo s Rheinbergem nebo fázový kontrast procházejícím jasným polem s dopadající fluorescencí). Vzhledem k tomu, že zvýšení kontrastu je do značné míry pod kontrolou mikroskopisty, nelze přeceňovat význam správného použití kondenzoru.
Kondenzor musí být správně zaostřen (viz část 3, nastavení mikroskopu pro Köhlerovo osvětlení), aby bylo dosaženo co nejkvalitnějšího obrazu. To platí bez ohledu na použitou metodu zvýšení kontrastu (světlé pole, fáze, tmavé pozadí). Nejzřetelnějším důsledkem rozostřeného kondenzoru při mikroskopii v jasném poli je výrazná ztráta rozlišovací schopnosti, která následně způsobuje „zkažený“ obraz s difrakčními halo kolem každého bodu obrazu. Ke stejnému výsledku dochází, pokud je při použití vysoce výkonného objektivu vynechána horní (krátkoohnisková) čočka nebo je ponechána převrácená a zadní ohnisková rovina objektivu není zcela zaplněna světlem.
Pokud se pokoušíme o mikroskopii s fázovým kontrastem se špatně zaostřeným kondenzorem, prstenec v kondenzoru často neodpovídá průměru fázového kroužku v zadní ohniskové rovině objektivu a jakékoli zvýšení kontrastu se ztrácí. Problémy se zaostřením kondenzoru mohou také vést ke špatné mikroskopii tmavého pozadí, pokud obraz záplatové zarážky zcela nezakrývá přímé osvětlení z objektivu. V další části této série se vrátíme k objektivu a budeme se zabývat délkou tubusu a tím, jak určit ohniskovou vzdálenost, zvětšení, clonu a další parametry vašich objektivů.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (ed). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (sada 4 svazků) 0-12-164725-0; pouze svazek 3 = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.
.