Jednou z vlastností enzymů, díky níž jsou tak důležité jako diagnostické a výzkumné nástroje, je jejich specifičnost vzhledem k reakcím, které katalyzují. Několik enzymů vykazuje absolutní specifitu, to znamená, že katalyzují pouze jednu konkrétní reakci. Jiné enzymy jsou specifické pro určitý typ chemické vazby nebo funkční skupiny. Obecně existují čtyři různé typy specifity:
- Absolutní specifita – enzym bude katalyzovat pouze jednu reakci.
- Skupinová specifita – enzym bude působit pouze na molekuly, které mají specifické funkční skupiny, například aminoskupiny, fosfátové a methylové skupiny.
- Vazbová specifita – enzym bude působit na určitý typ chemické vazby bez ohledu na zbytek molekulární struktury.
- Sterochemická specifita – enzym bude působit na určitý sterický nebo optický izomer.
I když enzymy vykazují velký stupeň specifity, kofaktory mohou sloužit mnoha apoenzymům. Například nikotinamidadenindinukleotid (NAD) je koenzymem pro velké množství dehydrogenázových reakcí, v nichž působí jako akceptor vodíku. Mezi ně patří reakce alkoholdehydrogenázy, malátdehydrogenázy a laktátdehydrogenázy
.