Biogênese mitocondrial e hiperativação metabólica limita a aplicação do ensaio de MTT na estimativa da inibição do crescimento induzido pela radiação | Relatórios científicos

Alterações na viabilidade metabólica induzida pela radiação não correlacionam com a inibição de crescimento

Etudando a inibição de crescimento induzida pela radiação em várias linhas celulares usando o ensaio MTT e contando o número de células, descobrimos que os resultados obtidos a partir de ensaios baseados na viabilidade metabólica não se correlacionam com o número real de células em diferentes pontos de tempo após a exposição à radiação. Uma vez que o ensaio MTT é amplamente utilizado com base no facto de representar verdadeiramente o número de células viáveis em qualquer amostra2,3,4. Nós examinamos este ensaio comparando os valores de MTT com o número de células. As células em crescimento exponencial foram expostas à radiação ionizante para analisar a inibição do crescimento, bem como a viabilidade metabólica, enumerando o número de células e a redução do sal de tetrzólio para formazan (ensaio MTT clássico; usado aqui como índice MTT), respectivamente. Em primeiro lugar, as células foram expostas a diferentes doses de radiação ionizante (2, 3, 5 e 7 Gy) para observar as mudanças dependentes da dose de radiação e correlação entre o número de células e a viabilidade metabólica. A quantidade de formazan formada (ou seja, índice MTT) às 48 horas após a irradiação nas três linhas celulares (A549, MDA-MB-231 e HeLa) mostrou redução de 20 a 35% (a 5 Gy e 7 Gy; Suplemento Fig. 1Ai a Ci) em relação às células não irradiadas, enquanto a diminuição do número de células foi na faixa de 70 a 90% (Suplemento Fig. 1Aii a Cii), indicando claramente uma falta de correlação entre viabilidade metabólica (índice MTT) e inibição de crescimento (número de células) em todas as doses de radiação; os dois parâmetros de resposta à radiação analisados.

Outras, para examinar a generalidade desta observação, examinamos a relação entre alterações no número de células (inibição de crescimento) e índice MTT (viabilidade metabólica) em 7 linhas de células não tumorogênicas e tumorogênicas (NIH/3T3, Raw 264,7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 e MDA-MB-231) em uma única dose (5 Gy), o que induziu quase 50% de inibição de crescimento nas três células testadas (Suplemento Fig. 1). Às 24 horas após a irradiação, todas as linhas celulares avaliadas mostraram ou igual a controle ou um aumento no valor do índice MTT (Fig. 1Ai a Gi), exceto Raw 264,7 (Fig. 1Bi), que é relativamente sensível à radiação. Por outro lado, uma diminuição significativa no número de células foi observada nestas condições (Fig. 1Aii a Gii). Às 48 horas após a irradiação, o número de células foi significativamente menor, variando de 43% (MDA-MB-231, Fig. 1Gii) a 76% (Raw 264,7, Fig. 1Bii) em relação ao controle, enquanto os valores do índice MTT mostraram apenas 10% a 37% de redução, respectivamente, com o máximo na linha de células Raw264,7 (Fig. 1Bi). Quando os valores do índice MTT (Δ OD) foram normalizados com o correspondente número de células, ele mostrou 1,4 a 3 vezes (em diferentes linhas de células) aumentou a viabilidade metabólica por célula (informação derivada) às 24 e 48 horas, o que reduziu ainda mais às 48 horas na maioria das linhas de células, exceto as células Raw264,7, NIH/3T3 e HeLa, mas permanece significativamente maior que o respectivo controle (Fig. 1Aiii a Giii). Estas observações demonstram claramente que o número de células, que é a verdadeira medida da inibição de crescimento induzida pela radiação e/ou da citotoxicidade, não se correlaciona com o ensaio baseado na viabilidade metabólica de alto rendimento (MTT), amplamente utilizado para a avaliação rápida da resposta à radiação, que parece ser devido ao aumento da viabilidade metabólica induzida pela radiação (Fig. 1Aiii a Giii). 1Aiii a Giii) de células expostas.

A exposição à radiação aumenta a viabilidade metabólica pelo aumento da massa mitocondrial

O aumento da viabilidade metabólica em células expostas à radiação pode resultar tanto de mitocôndrias hiperativas quanto do aumento da massa mitocondrial, pois a conversão do MTT em formazan ocorre principalmente nas mitocôndrias7,8,9,10. A radiação ionizante é conhecida por induzir massa mitocondrial e função nas células expostas20,21. Portanto, examinamos se o aumento da massa mitocondrial é responsável pelo aumento do índice MTT nas células expostas à radiação usando citometria de fluxo. Em linha com observações anteriores, verificamos que a massa mitocondrial média por célula foi significativamente aumentada em quase 1,4 vezes em MCF-7 (mínimo, Fig. 2Fi) para 4 vezes em Raw 264,7 (máximo, Fig. 2Bi) às 24 e 48 horas após a exposição à radiação (Fig. 2Ai a Gi). Simultaneamente, em células irradiadas, a produção de formazan por célula também foi melhorada nos respectivos pontos de tempo, quantificada em condições experimentais semelhantes (Fig. 2Aii a Gii). As imagens microscópicas às 24 horas após a exposição à radiação também mostram um aumento visível da deposição de formazan nas células irradiadas com respeito ao seu controle (Fig. 2Aiii a Giii). Os corpos contendo formazan (mitocôndrias) nas células de controle são menos intensos na cor, escassamente e uniformemente distribuídos no citoplasma, enquanto que nas células expostas à radiação eram escuras na cor e agrupadas na região perinuclear (Fig. 2Aiii a Giii). Estas imagens microscópicas fornecem evidências visuais e de suporte para o maior índice MTT ou maior viabilidade metabólica por célula em células irradiadas. Além disso, valida como um número reduzido de células sobreviventes irradiadas pode produzir uma quantidade muito maior de formazan (densidade de cor) por célula do que as respectivas células de controle não tratadas, resultando em falsa interpretação dos dados.

Radiação aumenta a viabilidade metabólica induzindo a biogênese mitocondrial

Mitocôndria é o principal local onde o MTT é reduzido para Formazan7,8,9,10, portanto o aumento da massa mitocondrial pode aumentar a viabilidade metabólica. O aumento da massa mitocondrial em células irradiadas pode ser obtido devido a duas razões primeiro, a radiação ionizante induz o bloqueio G2/M22,23 células presas na fase G2 terão maior número de mitocôndrias22,23,24 o que pode reduzir mais MTT a formazan em células irradiadas. Em segundo lugar, a radiação ionizante é conhecida por induzir biogênese mitocondrial20,21, resultando em aumento da massa mitocondrial. Para testar se a radiação induziu parada G2/M ou biogênese mitocondrial ou ambas são responsáveis pelo aumento da massa mitocondrial por célula em células irradiadas, examinamos as duas hipóteses seqüencialmente. Como, a radiação induzida aumenta a massa mitocondrial (Fig. 2Ai a Gi) foi observada em todas as linhas celulares, apenas células HeLa e MDA-MB-231 foram selecionadas aleatoriamente para entender os mecanismos subjacentes à radiação induzida para melhorar a viabilidade metabólica.

A distribuição do ciclo celular foi realizada às 24 e 48 horas após a radiação. Às 24 horas, 17 e 6% de excesso de população celular foram encontrados na fração G2/M do ciclo celular em células HeLa e MDA-MB-231, respectivamente. Entretanto, o bloco é completamente liberado às 48 horas (Fig. 3A), sugerindo que a parada do ciclo celular induzida pela radiação pode estar contribuindo parcialmente para o aumento da massa mitocondrial às 24 horas, mas não às 48 horas. Também é importante notar que quase 17% de aumento do número de células na fase G2/M não pode trazer cerca de 1,9 dobra (que é 90% alta) de mudança na massa mitocondrial e 1,5 dobra de mudança na redução de MTT para formazan às 24 horas em células de HeLa (Fig. 2Di e Dii). Embora o bloqueio do ciclo celular tenha sido completamente liberado às 48 horas, a massa mitocondrial e o aumento da viabilidade metabólica permaneceram significativamente maiores do que os respectivos controles. Estas observações, não suportam a proposição de que a radiação induzida pelo aumento da viabilidade metabólica é devido à parada do ciclo celular mediada pelo aumento da massa mitocondrial, como relatado anteriormente no caso do tratamento de compostos polifenólicos18,25,

Outra, para testar a hipótese de que a atividade hiper metabólica induzida pela radiação que se correlaciona com o aumento da massa mitocondrial nas células expostas (Fig. 2Ai a Gi) é devido à biogênese mitocondrial induzida pela radiação, analisamos o número de cópias mtDNA nas células de controle e nas células expostas à radiação. O número de cópias do gene Leu t-RNA foi medido para o número de cópias do mtDNA codificado do genoma mitocondrial e normalizado com pol-gama nuclear, usando o método de PCR semi-quantitativo. Tanto HeLa quanto MDA-MB-231 células mostraram 18% e 31% melhoraram o número de cópias de mtDNA após 24 horas de exposição à radiação, o que aumenta ainda mais até 138% em HeLa e permanece 21% alto em MDA-MB-231 do que as células controle em 48 horas (Fig. 3B). Além disso, examinamos o nível de expressão dependente do tempo das proteínas PGC-1α (Coactivador gama do receptor peroxisómico activado pelo proliferador 1-alfa) e TFAM (Factor de Transcrição Mitocondrial A) usando Western blot. Estas duas proteínas são o principal regulador da biogênese mitocondrial e da manutenção nas células26,27,28. Curiosamente, aumento dependente do tempo tanto na expressão PGC-1α quanto na TFAM (Fig. 3C) foi observado nas células (HeLa e MDA-MB-231) expostas à radiação, o que se correlaciona com o aumento da massa mitocondrial em 24 horas (Fig. 2Di e Gi). Além disso, verificamos se a massa mitocondrial aumentada é funcional e tem expressão aumentada da proteína SDH-A, que é a enzima redutora primária do MTT em Formazan7,8,9,10. Os níveis proteicos de SDH-A também foram encontrados aumentados após 8 e 24 horas de exposição à radiação (Fig. 3C), o que se correlaciona com o aumento do índice de MTT ou aumento da viabilidade metabólica em células de HeLa e MDA-MB-231 (Fig. 1 e 2). Também foram encontrados níveis de SDH-A significativamente aumentados em outras linhas celulares (dados não mostrados). Além de validar a hipótese, a biogênese mitocondrial induzida por radiação resulta em aumento da viabilidade metabólica; inibimos a biogênese mitocondrial usando cloranfenicol29,30. Verificamos que o cloranfenicol, em concentração não tóxica, reduziu significativamente a biogênese mitocondrial induzida pela radiação, em ambas as linhas celulares (Fig. 3D). Quando MTT e cinética de crescimento (Fig. 3E e F) foram realizados em células tratadas com cloranfenicol antes da exposição à radiação, mostrou formação Formazan significativamente baixa do que apenas a radiação (Fig. 3E), sugerindo assim que a radiação induzida aumentou a viabilidade metabólica é principalmente devido à biogênese mitocondrial. A diferença entre a curva de inibição do crescimento induzido pela radiação obtida no ensaio MTT e a contagem de células permanece apenas 8% nas células tratadas com cloranfenicol (Fig. 3E e F), que foram 25% e 33% nas células de HeLa e MDA-MB-231 (Fig. 1Di-ii e Gi-ii), respectivamente. Esses resultados substanciam a hipótese de que a radiação induzida aumenta a massa mitocondrial e a viabilidade metabólica vem da biogênese mitocondrial induzida pela radiação em grande parte, que é regulada pela PGC-1α e TFAM induzidos pela radiação.

Radiação induz hiper-ativação de mitocôndrias

Em resultados anteriores, observamos que a radiação ionizante induz a massa mitocondrial em células, que parece ser responsável pelo aumento da viabilidade metabólica (índice MTT) em células irradiadas; entretanto, sabe-se que a radiação também induz hiper-ativação de mitocôndrias individuais em células irradiadas31. Para determinar se o índice MTT aumentado foi observado devido ao aumento da massa mitocondrial apenas ou à hiper-ativação das mitocôndrias também induzida pela radiação, medimos ΔΨm (potencial de membrana mitocondrial, MMP) por microscopia de fluorescência usando TMRM. As células irradiadas (às 24 hrs.) mostraram mitocôndrias perfuradas de vermelho vivo sugestivo de alta ΔΨm, em comparação ao controle (Fig. 4A). Este resultado foi ainda validado pela estimativa quantitativa de ΔΨm usando DiOC6 por citometria de fluxo. As células de HeLa mostraram 2,4 a 2,8 vezes a MMP aumentou, entretanto, as células MDA-MB-231 mostraram 1,3 vezes a MMP induzida pela radiação em ambos os pontos de tempo, respectivamente (Fig. 4B). Este potencial elevado de membrana mitocondrial correlaciona-se com a formação de múltiplas e altas formações de formazan em cada mitocôndria de células irradiadas (Figura 2Aiii), sugerindo atividade hipercomplexa II (SDH) (Fig. 2Aii a Gii), provavelmente devido ao aumento da radiação induzida ΔΨm. Esta observação está em linha com achados anteriores em outros estudos, que sugerem que o Complexo II é mais eficiente em estabelecer e manter ΔΨm sob condições de estresse32,33. O aumento de ΔΨm devido ao Complexo II hiperativo garante maior atividade de outras desidrogenases mitocondriais também, o que pode estar contribuindo para o aumento da formação de formazan além de SDH.

Oxidação conduzida por succinato via complexo-II (SDH) foram encontrados com a contribuição significativa para a geração de ROS mitocondrial melhorada34. Portanto, analisamos o nível de superóxido mitocondrial em células controle e irradiadas para testar o fato de que mitocôndrias hiper metabolicamente ativas deveriam produzir mais radicais superóxidos. As células coradas com MitoSox (indicador de ROS mitocondrial) foram analisadas no citômetro de fluxo. As células irradiadas mostram fluorescência MitoSox significativamente melhor do que o seu respectivo controlo. Ambas as linhas celulares mostraram quase 1,25 dobras de aumento nas ROS mitocondriais às 24 horas, entretanto, aumentou ainda mais para 1,65 dobras em HeLa e 1,5 dobras em células MDA-MB-231 às 48 horas após a exposição à radiação (Fig. 4C). Como a SDH mitocondrial desidrogenase é o principal contribuinte da redução da MTT7,8,9,10, esses resultados validam que a observação do aumento da ROS é diretamente proporcional ao aumento da atividade da SDH34. Esses resultados sugerem que a massa mitocondrial aumentada consiste de mitocôndrias funcionalmente hiperativas, reduzindo maior quantidade de MTT em formazan por célula em amostras irradiadas.

Radiação induz acúmulo de cálcio nas mitocôndrias

A radiação ionizante perturba a homeostase celular do cálcio levando ao aumento da liberação de cálcio do retículo endoplasmático (ER) para o citoplasma, que é então tamponado pelas mitocôndrias funcionais na região perinuclear das células35,36. A homeostase alterada do cálcio também induz a produção de ROS (espécies reativas de oxigênio) e biogênese mitocondrial35,36,37,

Para investigar, se o aumento da viabilidade metabólica observada às 24 e 48 horas é devido ao aumento dos níveis de Ca2+ citoplasmáticos e mitocondriais, foi estimado o Ca2+ celular livre e mitocondrial. As células controle e tratadas foram coradas com Fluo-3AM (indicador Ca2+) e Rhod-2AM (indicador específico de Ca2+ mitocondrial)38 nos respectivos pontos de tempo e analisadas no citômetro de fluxo. O aumento significativo do nível de cálcio foi observado nas células irradiadas, que foi aumentado em quase 1,4 vezes (40%) em ambas as linhas celulares (HeLa e MDA-MB-231) investigadas, como sugerido pelo aumento da fluorescência Fluo-3 às 8 horas, que reduz marginalmente às 24 horas (Fig. 5A). Curiosamente, ainda mais radiação induziu aumento na Ca2+ mitocondrial (2,4 vezes em HeLa e 1,6 vezes em MDA-MB-231, Fig. 5B). Esta observação foi ainda verificada através da visualização das células coradas ao microscópio de fluorescência. As células coradas com Mitotracker Red, Fluo-3AM e Rhod-2AM independentemente às 24 horas após o tratamento com radiação foram observadas. O Fluo-3AM e o Rhod-2AM apresentam ambos forte fluorescência perinuclear puncionada com o mesmo padrão mostrado pelo mitotracker red nas células correspondentes expostas à radiação (Fig. 5C), sugerindo que o aumento do Ca2+ citoplasmático é acumulado nas mitocôndrias. Além disso, sinais específicos de Ca2+ de mitocôndrias em células coradas em Rhod-2AM, validam esta observação. Curiosamente, células MDA-MB-231 mostraram já elevado Ca2+ mitocondrial (coloração Rhod-2-AM) e agrupamento mitocondrial perinuclear (coloração Mitotracker Red) em células controle, que aumenta ainda mais após a irradiação, esta poderia ser a razão pela qual esta célula mostrou menor aumento na biogênese mitocondrial induzida pela radiação e formação de formazan, posteriormente. Demonstramos em nosso estudo anterior que a radiação causa acúmulo de Ca2+ nas mitocôndrias levando a danos mitocondriais e mitofagia36. Mitocôndrias com alto potencial de Ca2+ e aumento da membrana mitocondrial acumulam mais A23187 e mostram uma fluorescência mais brilhante sob microscópio sobre a excitação UV. Contudo, as mitocôndrias permanentemente danificadas apresentam uma fluorescência muito elevada e aparecem como corpos redondos no interior da célula36. Para observar o acúmulo de Ca2+ nas mitocôndrias sob estas condições experimentais, nós coramos células HeLa e MDA-MB-231 irradiadas às 24 horas após a exposição (Fig. 5C). As células irradiadas também mostraram maior acúmulo de corpos indicando mitocôndrias danificadas pela radiação induzida. Células irradiadas mostram maior Mitotracker Red, Fluo-3AM e Rhod-2AM fluorescência na região perinuclear (Fig. 5C), onde mitocôndrias formam uma rede com retículo endoplasmático (RE) e acumulam a maior parte do vazamento de Ca2+ induzido por estresse do RE e protegem as células da morte39. Este achado sugere que Ca2+ liberado das lojas após a exposição à radiação é acumulado principalmente nas mitocôndrias. É relatado anteriormente que o Ca2+ elevado na matriz mitocondrial aumenta a atividade do SDH40. Portanto, correlacionamos que Ca2+ acumulado em mitocôndrias aumentou a atividade do complexo SDH levando a mitocôndrias hiperativas e aumento da viabilidade metabólica em células expostas à radiação.

Acumulação de cálcio nas mitocôndrias leva ao estado metabólico hiperativo celular

Outras, para substanciar o papel do Ca2+ no aumento da formação de formazan, testamos se o distúrbio de Ca2+ apenas nas células pode aumentar a viabilidade metabólica. Para testar esta proposição, as células foram tratadas com Ca2+ ionóforo A23187 (2 µM, que aumenta o Ca2+ citoplasmático, o mesmo que a radiação ionizante) por 1 hora e analisamos a viabilidade metabólica às 4, 8 e 24 horas após o tratamento. Curiosamente, as células tratadas com A23187 mostraram viabilidade metabólica significativamente aumentada (1,6 vezes) por célula a 8 & 24 h em HeLa e 4 & 8 h em MDA-MB-231 (Fig. 6A), após o tratamento. Estes resultados sugerem que o aumento do Ca2+ citoplasmático aumenta a viabilidade metabólica, aumentando o acúmulo de Ca2+ nas mitocôndrias (Fig. 5C). Também verificamos se a inibição do acúmulo de Ca2+ nas mitocôndrias pode dificultar o aumento da massa mitocondrial induzida pela radiação. Curiosamente, verificamos que células tratadas com inibidor de Ca2+ uniporter mitocondrial, Ruthenium Red (RuR, que inibe o acúmulo de Ca2+ em mitocôndrias) mostraram um aumento significativamente baixo no conteúdo mitocondrial (radiação induzida) em comparação com a radiação isolada (Fig. 6B). Sabe-se que o Ca2+ aumentado induz biogênese mitocondrial através da CaMKII (Calmodulin Kinase-II)37,41, que também é uma proteína residente mitocondrial conhecida por regular a expressão PGC-1α,41,42. Portanto, concluímos que a inibição do acúmulo de Ca2+ nas mitocôndrias com rutênio vermelho reduziu a massa mitocondrial, provavelmente pela inibição da biogênese mitocondrial. Além disso, para validar se a radiação induziu aumento do Ca2+ citoplasmático e seu acúmulo nas mitocôndrias leva ao aumento da viabilidade metabólica nas células irradiadas, tratamos as células com BAPTA-AM (quelante intracelular de cálcio) e RuR, 30 minutos antes da irradiação. A quelação de Ca2+ citoplasmático aumentado com BAPTA-AM (Fig. 6C) e a inibição do acúmulo de Ca2+ nas mitocôndrias com RuR (Fig. 6D), ambos revogaram a radiação induzida pela maior viabilidade metabólica após 24 e 48 horas de irradiação em células HeLa e MDA-MB-231 (Fig. 6C e D). Estes resultados sugerem que o distúrbio induzido pela radiação na homeostase Ca2+ também tem um papel importante na hiperativação das mitocôndrias e no aumento da viabilidade metabólica, provavelmente a montante da biogênese mitocondrial.