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Streptococci são os habitantes mais abundantes da boca humana (6, 24), e ganham acesso freqüente à corrente sanguínea através de lesões periodontais ou abrasões orais criadas por atividades rotineiras (32). Isto pode levar a doenças graves, incluindo endocardite infecciosa (IE) (28) e bacteremia neutropenica (29). A taxonomia dos estreptococos orais tem sido uma fonte de confusão (4, 9, 20, 22, 31). A sequência do gene 16S rRNA esclareceu imensamente a situação (13); no entanto, esta abordagem carece da sensibilidade necessária para distinguir certas espécies estreitamente relacionadas, incluindo Streptococcus mitis e Streptococcus oralis (12), ou para permitir a tipagem de estirpes ou a análise filogenética dentro das espécies. Genes com maior variabilidade foram, portanto, examinados, incluindo o 16S-23S rRNA intergenérico transcrito espaçador (ITS) (2), os genes de administração doméstica codificadores de proteínas (1, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 23), ou ambos (17, 18). Ainda não se chegou a um consenso sobre o(s) gene(s) mais adequado(s) para estes fins. Além disso, embora estudos anteriores tenham identificado estreptococos orais de hemoculturas clínicas usando métodos de seqüenciamento definitivo (12, 23, 30), nenhum relatou informações clínicas detalhadas sobre a doença subjacente. Nós nos propusemos a fazer ambos.

Culturas de sangue realizadas no Virginia Commonwealth University Medical Center Hospital de Maio de 2003 a Maio de 2008 foram presumivelmente identificadas como contendo estreptococos pelo laboratório de microbiologia clínica. Um script de computador foi usado para excluir espécies não orais. Para evitar análises de contaminantes, as placas de isolamento foram solicitadas apenas quando dois ou mais relatos tiveram origem em culturas separadas de um mesmo paciente. Uma colónia de cada placa de isolamento disponível foi cultivada em cultura de caldo e examinada macroscopicamente e microscopicamente. Se fossem observadas quaisquer diferenças em culturas separadas derivadas do mesmo paciente, ambas as culturas eram retidas. Caso contrário, uma única cultura de cada paciente foi criopreservada, e alíquotas foram removidas para amplificação PCR.

Para determinar a identidade da espécie e a relação filogenética de cada isolado, o 16S-23S ITS foi amplificado usando os primers 6R e 13BF descritos anteriormente (2). Quando os produtos não foram obtidos de alguns isolados, notamos que os três nucleotídeos finais do primer 6R não se alinharam com as sequências 23S rRNA no GenBank de várias espécies de interesse. Portanto, encurtamos e simplificamos o primer 6R, criando o 6R-S, e encurtamos o primer 13BF para corresponder à sua temperatura de recozimento (ver Tabela S1 no material suplementar). Uma modificação similar do primer 6R foi relatada recentemente (18). Usando esses primers, os amplicons PCR foram obtidos de todos os isolados e submetidos para análise de sequência de DNA capilar.

A maioria das sequências de DNA continha o ITS completo e porções dos genes 16S e 23S rRNA, que foram alinhados com sequências ITS de cepas do tipo disponíveis no GenBank ou determinadas por nós a partir de cepas obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Descobrimos que flanquear as seqüências 16S e 23S, embora não mantidas na maioria das seqüências publicadas, facilitou o alinhamento dos ITS. De fato, pelo menos quatro sequências de cepas do tipo foram publicadas (18) nas quais um CTAAGG localizado 78 bp antes do final do gene 16S rRNA 3′ parece ter sido confundido com uma sequência de hexanucleotídeos idêntica definida anteriormente (2) como o início do ITS. Seqüências de ITS aparadas (2) foram então comparadas e alinhadas com o software MEGA 4 (25) para construir uma árvore filogenética vizinha (Fig. 1).

Foi sugerido anteriormente que a análise ITS por si só é suficiente para a identificação de espécies de estreptococos orais, incluindo a das espécies estreitamente relacionadas S. mitis e S. oralis. Foram sugeridas deleções de base única conservadas em dois locais e um ITS de 246 bp de comprimento total como característico de S. oralis, enquanto que S. mitis foi proposto para faltar as deleções e possuir um ITS de 248 a 249 bp (2, 3). Em nosso estudo, encontramos isolados de ambas as espécies que possuíam ambas as deleções ou nenhuma delas, juntamente com a sobreposição de comprimentos de ITS. Assim, os S. oralis e S. mitis isolados não puderam ser distinguidos de forma confiável por esses critérios. Outro estudo sugeriu que a análise da sequência de ITS, embora não seja suficiente para distinguir S. oralis e S. mitis, é suficiente para identificar muitas outras espécies de estreptococos orais, incluindo as pertencentes ao grupo dos anginosus (18). Entretanto, encontramos um isolado da espécie S. intermedius (VMC38) do grupo de anginosus que não pôde ser classificado pelo ITS (ver Tabela S1 no material suplementar).

Um grande número de isolados, particularmente para S. mitis e Streptococcus constellatus, também possuía sequências idênticas, excluindo a análise filogenética. Seqüências idênticas também foram obtidas a partir de cinco pares de isolados originários dos mesmos pacientes (dados não mostrados).

Porque a análise ITS não foi suficiente para nossos propósitos, sequenciamos um segundo alvo comum – o gene sodA, codificando a superóxido dismutase dependente de manganês (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Isto permitiu a exclusão de vários isolados. Os pares de estirpes mencionados acima como sendo originários dos mesmos sujeitos e tendo sequências ITS idênticas também possuíam sequências SODA idênticas, confirmando que os isolados eram idênticos, e um isolado de cada par foi descartado. Dois isolados foram descartados devido a um aparente erro no manuseio da deformação, e outro não foi retido porque as seqüências ITS e sodA indicavam que era uma deformação de Enterococcus faecalis. Uma árvore filogenética derivada dos restantes isolados é mostrada na Fig. 1.

O alinhamento do sodA foi superior ao do ITS para análise filogenética. Os únicos isolados com sequências idênticas de sodA foram duas cepas de S. mitis e duas cepas de Streptococcus vestibularis. O alinhamento do sodA também foi mais útil para a determinação das espécies. Todas as cepas de referência foram bem separadas umas das outras na árvore filogenética. O resultado foi apenas quatro atribuições ambíguas de espécies para o SOdA, em comparação com 15 para o ITS (ver Tabela S1 no material suplementar). Nos casos em que a designação de uma única espécie foi consistente com as sequências ITS e sodA, essa designação foi utilizada. Apenas 3 dos 58 isolados clínicos finais não puderam ser identificados com confiança usando este método. Os isolados VMC1 e VMC43 produziram sequências ITS demasiado curtas para serem informativas, apesar das repetidas tentativas de sequenciamento, e o VMC58 foi identificado de forma inconsistente pelas sequências ITS e sodA (Fig. 1; Tabela S1). Confirmamos a identidade da espécie destes isolados utilizando uma base de dados recentemente publicada contendo sequências de sete genes domésticos de 420 cepas bem caracterizadas de estreptococos, incluindo sodA, pfl, e pyk (1). Seqüências dos genes pfl e/ou pyk de todas as cepas questionáveis foram determinadas e alinhadas com as seqüências da base de dados eMLSA.net (http://www.emlsa.net/), assim como as seqüências de sodA existentes. Em todos os casos, as atribuições das espécies pfl e pyk estavam de acordo com as do SOdA. Além disso, o alinhamento do sodA indicou que a sequência VMC58, embora divergente do tipo de estirpe, estava dentro de um cluster de 13 Streptococcus infantis isolados na base de dados (dados não mostrados). A identificação consensual das espécies de todos os isolados incluídos no estudo está indicada na Fig. 1 e nas Tabelas S1 e S2 no material suplementar.

Embora estes resultados sugiram que a análise do sodA por si só seja suficiente para identificar a maioria das cepas, recomendamos a inclusão de pelo menos um gene adicional codificador de proteínas para todas as cepas. Muitos estreptococos orais são naturalmente competentes, e foram relatados casos de aquisição de genes de domesticação estranhos, incluindo o SOdA (1, 12). Isso não foi aparente em nosso estudo, mas houve casos de ITS quiméricos (VMC38 e VMC50) e sequências de sodA (VMC33). Duas publicações recentes foram mais longe, cada uma sugerindo seqüenciamento de um conjunto diferente de sete genes domésticos para tipagem de seqüências multilocus (7) ou análise de seqüências multilocus (1). Essas abordagens dependem da análise de um número maior de genes para fornecer maior resolução e minimizar os efeitos de genes ocasionais quiméricos ou estranhos (1, 7). Estes esquemas também permitem análises filogenéticas mais sofisticadas do que são possíveis com apenas dois ou três genes. Ocasionalmente experimentamos dificuldades, no entanto, na amplificação e sequenciamento de pfl e pyk e pouco sucesso com dois dos outros genes recomendados, mapa e ppaC (1). Outro estudo recente relatou dificuldades semelhantes (27). Assim, a escolha de genes adicionais pode requerer testes empíricos, mas aqueles empregados nas análises de sete genes devem ser explorados primeiro, já que grandes coleções de seqüências de cepas bem caracterizadas estão disponíveis para comparação (1, 7).

Ao nosso conhecimento, este é apenas o segundo relato de um Streptococcus australis (12) ou S. infantis (30) isolado da hemocultura. A única outra associação desta última espécie com qualquer doença vem de dois relatos de seu isolamento do escarro de adultos com fibrose cística (17, 26). Portanto, é interessante que um adulto com fibrose cística foi a fonte do nosso isolado de S. infantis, VMC58 (ver Tabela S2 no material suplementar).

Dados de susceptibilidade a antibióticos estão incluídos na Tabela S2 e estão em grande parte de acordo com estudos anteriores (8). A Tabela S2 também fornece dados clínicos e demográficos para os pacientes fonte, categorizando-os com base na doença principal subjacente: doença médica, malignidade, IE, ou cirurgia/trauma. Todos os sujeitos do EI foram diagnosticados clinicamente, e todos, exceto o caso VMC56 (Tabela S2), foram classificados como “EI definitivo” pelos critérios modificados da Duke (16). A única exceção tinha um histórico de EI prévio e uso de drogas intravenosas (IVDU), que em conjunto com as hemoculturas positivas resultariam em categorização como “possível EI”. Foram também examinados dados sobre possíveis fontes de infecção, incluindo linhas centrais, endoscopia gastrointestinal, mucosite oral, condições dentárias e IVDU. A IVDU foi encontrada para 9 dos 13 pacientes do EI e apenas para 1 outro paciente do estudo (Tabela S2). Esta diferença foi estatisticamente significativa (P < 0,0001; teste exacto de Fisher). Assim, embora este estudo tenha sido focado em espécies orais, a UID foi um fator de risco esmagador.

Nossa análise filogenética não revelou associações estatisticamente significativas entre qualquer espécie ou tipo clonal particular e doença subjacente ou outros parâmetros clínicos, incluindo contagem de leucócitos, temperatura mais alta, tamanho da vegetação, válvulas afetadas ou morte do paciente. Um estudo anterior continha informação suficiente para identificar espécies isoladas de pacientes neutropenicos (12). Nossos resultados foram semelhantes, no sentido de que 11 dos 12 isolados naquele estudo e 9 dos 10 isolados no nosso (Tabela S2) eram S. mitis ou S. oralis, estreitamente relacionados. Em nosso estudo, essas duas espécies, consideradas em conjunto, eram significativamente mais prováveis que as 12 espécies restantes combinadas a serem isoladas de pacientes neutropenos (P = 0,004; teste exato de Fisher). Isto pode refletir a prevalência destas espécies na cavidade oral. É interessante, no entanto, que esta tendência não se tenha transmitido ao IE. Combinando nossos dados com os do mesmo estudo (12) para neutropenia e IE, S. oralis e S. mitis foram isolados de 20 de 22 casos de neutropenia e apenas 15 de 27 casos de IE, diferença estatisticamente significante (P = 0,01; teste exato de Fisher). Como em estudos anteriores (11, 12, 30), o número de amostras limitou nossa capacidade de avaliar com confiança outras possíveis associações entre espécies e doenças ou características clínicas particulares. Entretanto, ao emparelhar a identificação definitiva das espécies com as características clínicas e demográficas de cada paciente fonte (Tabela S2), procuramos tornar nossos resultados adequados para meta-análise ou outros estudos utilizando dados combinados.