Illustrated in Figure 2(a) is the fluorescence emission profile using the DAPI-FITC filter block and a culture of Indian Muntjac deerskin fibroblast cells stained with Alexa Fluor 488 conjugated to phalloidin, which binds to the intracellular filamentous actin network. A absorção máxima de luz visível do Alexa Fluor 488 é de 495 nanômetros e a emissão máxima ocorre a 519 nanômetros na região verde do espectro. Além disso, a amostra foi corada simultaneamente com DAPI (visando DNA no núcleo celular; excitação a 358 nanômetros e emissão a 461 nanômetros) e MitoTracker Red CMXRos (visando mitocôndrias; emissão vermelha). Note a ausência de sinal do fluoróforo vermelho (MitoTracker), mas a presença de fluorescência verde brilhante exibida pelos filamentos de actina e o sinal azul de intensidade ligeiramente inferior do DAPI no núcleo celular.
Uma fina secção do intestino de rato corada com Alexa Fluor 350 wheat germ germaglutinininin, uma lectina fluorescente azul específica do muco das células da taça, é apresentada na Figura 2(b). Além disso, a amostra foi corada simultaneamente com Alexa Fluor 568 phalloidin (actina filamentosa; emissão de 600 nanômetros) e SYTOX Green (núcleos; excitação de 504 nanômetros e emissão de 523 nanômetros). Notar o baixo nível de sinal do fluoróforo azul (Alexa Fluor 350), mas a fluorescência verde brilhante dos núcleos na amostra de tecido devido à fluorescência verde SYTOX. Esta combinação de filtro de dupla excitação elimina eficazmente o sinal da sonda vermelha (Alexa Fluor 568).
Figure 2(c) demonstra a intensidade de emissão de fluorescência de uma cultura de canguru de rato (PtK2) células epiteliais que foram imunofluorescentemente rotuladas com anticorpos monoclonais de rato de alfa-tubulina-bovino primários, seguidos de fragmentos de tecido de cabra anti-rato Fab conjugados ao Alexa Fluor 488. Além disso, a amostra foi rotulada com Hoechst 33258, que se liga seletivamente ao DNA no núcleo celular, e MitoTracker Red CMXRos (que visa mitocôndrias; fluorescência vermelha). Observe a proeminente coloração verde da rede de microtubos intracelular que se estende por todo o citoplasma, e a emissão azul da Hoechst 33258 ligada ao DNA no núcleo. A célula na porção inferior da imagem parece estar a sofrer mitose no estado prometafásico ou metafásico.
Células suíças de rato (linha 3T3) imunofluorescentemente rotuladas com anticorpos monoclonais primários anti-citocromo oxidase de rato, seguidos por fragmentos de Fab anti-rato de cabra conjugados com o Alexa Fluor 568 são ilustrados na Figura 2(d). O espécime também foi rotulado com várias sondas adicionais, incluindo a lectin Helix pomatia agglutinininininin (HPA) conjugada ao Alexa Fluor 488 (emissão verde), que se liga seletivamente às glicoproteínas do aparelho Golgi nesta linha celular. Os filamentos de actina citoesquelética foram corados com Alexa Fluor 680 (excitação vermelha; emissão quase infravermelha) e o DNA nuclear foi rotulado com DAPI (emissão azul). Observe a proeminente coloração verde do aparelho de Golgi e a intensidade de fluorescência azul observada nos núcleos.
Emissão de fluorescência de uma fina secção de rim de rato corada com múltiplos (3) fluoróforos é apresentada na Figura 2(e). Os núcleos na secção tecidual foram alvo com a sonda de ácido nucleico DAPI, que tem uma excitação máxima de 358 nanômetros e uma emissão máxima de 461 nanômetros quando ligada ao DNA em culturas celulares e secções teciduais. Além disso, a secção criostal também foi corada simultaneamente com a aglutinina de germe de trigo Alexa Fluor 488 (glomérulos e túbulos convolutos) e a falloidina Alexa Fluor 568 (actina filamentosa e borda da escova). Note a presença de sinal das sondas azul (DAPI) e verde (Alexa Fluor 488), mas a ausência de fluorescência vermelho alaranjada devido ao Alexa Fluor 568 combina na rede de actina e borda de pincel.
Emissão de autofluorescência de uma seção fina de grão de milho (Zea mays) é demonstrada na Figura 2(f). A autofluorescência endógena em tecidos vegetais surge de uma variedade de biomoléculas, incluindo clorofila, caroteno e xantofila. Nas regiões de excitação ultravioleta e azul, a clorofila tem uma faixa de absorção com alto coeficiente de extinção e produz uma quantidade significativa de fluorescência quando excitada com comprimentos de onda entre 350 e 500 nanômetros. Para o tecido do grão de milho ilustrado acima, note a presença de intensidade de emissão de autofluorescência nas regiões espectrais azul e verde, característica da combinação do filtro de fluorescência Nikon DAPI-FITC.