Van ‘t Hoff conquistou sua reputação mais antiga no campo da química orgânica. Em 1874, ele contabilizou o fenômeno da atividade óptica assumindo que as ligações químicas entre átomos de carbono e seus vizinhos eram direcionadas para os cantos de um tetraedro regular. Esta estrutura tridimensional foi responsável pelos isómeros encontrados na natureza. Ele divide o crédito por isso com o químico francês Joseph Le Bel, que independentemente teve a mesma idéia.
Três meses antes de seu doutorado ser concedido, Van ‘t Hoff publicou esta teoria, que hoje é considerada como a base da estereoquímica, primeiro em um panfleto holandês no outono de 1874, e depois em maio seguinte em um pequeno livro francês intitulado La chimie dans l’espace. Uma tradução alemã surgiu em 1877, numa altura em que o único trabalho que Van ‘t Hoff conseguia encontrar era na Escola Veterinária em Utrecht. Nestes primeiros anos a sua teoria foi largamente ignorada pela comunidade científica, e foi duramente criticada por um químico proeminente, Hermann Kolbe. Kolbe escreveu:
“Um Dr. J. H. van ‘t Hoff da Escola Veterinária em Utrecht não tem nenhum gosto, aparentemente, pela investigação química exata. Ele considerou mais conveniente montar Pegasus (aparentemente emprestado da Escola Veterinária) e proclamar em seu ‘La chimie dans l’espace’ como, em seu arrojado vôo para o topo do químico Parnassus, os átomos lhe pareciam estar dispostos no espaço cósmico”
Entretanto, por volta de 1880, o apoio à teoria de Van ‘t Hoff por químicos tão importantes como Johannes Wislicenus e Viktor Meyer trouxe reconhecimento.
Em 1884, Van ‘t Hoff publicou sua pesquisa sobre cinética química, intitulada Études de Dynamique chimique (“Estudos de Dinâmica Química”), na qual ele descreveu um novo método para determinar a ordem de uma reação usando gráficos e aplicou as leis da termodinâmica aos equilíbrios químicos. Ele também introduziu o conceito moderno de afinidade química. Em 1886, ele mostrou uma semelhança entre o comportamento de soluções diluídas e gases. Em 1887, ele e o químico alemão Wilhelm Ostwald fundaram uma influente revista científica chamada Zeitschrift für physikalische Chemie (“Journal of Physical Chemistry”). Ele trabalhou na teoria da dissociação de electrólitos de Svante Arrhenius e em 1889 forneceu uma justificação física para a equação de Arrhenius. Em 1896, tornou-se professor na Academia de Ciências Prussiana em Berlim. Seus estudos sobre os depósitos de sal em Stassfurt foram uma importante contribuição para a indústria química da Prússia.
Van ‘t Hoff tornou-se professor de química e física no Colégio Veterinário em Utrecht. Ele então trabalhou como professor de química, mineralogia e geologia na Universidade de Amsterdã por quase 18 anos antes de eventualmente se tornar presidente do departamento de química. Em 1896, Van ‘t Hoff mudou-se para a Alemanha, onde terminou a sua carreira na Universidade de Berlim em 1911. Em 1901, ele recebeu o primeiro Prêmio Nobel de Química por seu trabalho com soluções. Seu trabalho mostrou que soluções muito diluídas seguem leis matemáticas que se assemelham muito às leis que descrevem o comportamento dos gases.