実験デザイン
研究仮説を検証するため、無作為化クロスオーバー要因デザインを使用しました。 安静時心拍数、身体組成、筋力の予備検査の後、各参加者は3つの運動様式からなる無作為に並べられた6つの運動セッションを行った。 AEE、HIIT、HIRTの3つの運動様式と、2つの急性無作為化栄養介入からなる無作為順序の6つの運動セッションを行った。 CHOとPROである（図1）。 参加者は、各運動モードを2回実施し、毎回異なる栄養介入を行った。 エストラジオールとコルチゾールの濃度を測定するために、各運動セッションの前に唾液サンプルを採取し、コルチゾール濃度を測定するために、各運動セッション後に唾液サンプルを採取した。 運動セッションは、1日の同じ時間帯に、2時間以内に、各セッションの間に少なくとも48時間空けて行い、その順番は、無作為割付ソフトウェア（version 1.0.0; Isfahan, Iran）を用いてランダムに割り当てられた。 被験者には、十分な水分補給、食後3時間、5時間前にカフェインを控えること、すべての運動セッションの24時間前に激しい運動を控えることを指示した。
実験プロトコル概略図。 REE、安静時エネルギー消費量（kcal/日）；RER、呼吸交換比；CHO、炭水化物；PRO、タンパク質；HRR、心拍予備能；AEE、有酸素性持久運動；HIIT、高強度間隔走；HIRT、高強度抵抗性トレーニング。
参加者
無月経の大学生でレクリエーションに積極的な女性21名がこの研究に参加するために登録された；1名は無関係な怪我のために参加を辞退した。 20人の女性（n = 20）が研究を完了し（表1）、統計解析に含まれた。 研究プロトコルは、大学の施設審査委員会の承認を得ており、従ったすべての手順は、2008年に改訂された1975年のヘルシンキ宣言に準拠している。 参加に先立ち、参加者全員が書面によるインフォームドコンセントを行い、健康歴に関する質問票に記入した。 この研究に参加するためには、参加者は18歳から35歳までの女性で、競技選手を除き、週に1時間から5時間の有酸素運動やレジスタンス運動を積んでいると定義されるレクリエーション活動家でなければならない。 参加者は、運動不足、妊娠、心血管や神経筋の健康リスク、怪我、心臓、肺、腎臓、肝臓の病気がある場合は除外された。
心拍予備量測定および身体組成評価
参加者は8時間の絶食後に応用生理学研究所に報告し、15分間休息した。 安静時心拍数（RHR）はPolar心拍計（Polar FT1, Polar USA, Port Washington, NY, USA）を用いて測定し、年齢予測最大心拍数（MHR）は決定した。 運動時目標心拍数（THR）はKarvonenの式を用いて算出した． 各運動時間中、心拍数（HR）は前述のHRモニターを用いて測定された。 ベースラインデータとして、Hologic Dual Energy X-ray Absorptiometer (DEXA, Hologic Discovery W, Bedford, MA, USA) を用いて、装置のデフォルトソフトウェア (Apex software version 3.3) を用いて、全身組成を測定した（パイロットデータは発表されていない）。 この装置はファンビームによる直線的な撮影を行い、脂肪量（FM）、除脂肪量（LM）、体脂肪率（% fat）を含む体組成の3区分評価を行うものである。 金属類をすべて取り除いた後、被験者はプラットフォームの中央に仰臥位で横たわり、両手は脇腹の近くで下向きにした。 被験者はスキャンの間、静止し、通常の呼吸をするように指示された。 すべてのスキャンは同じDEXA認定技術者によって行われた。 装置は、有効な結果を保証するために、テスト前に製造者の推奨に従って較正された。 当研究室での過去のテスト・リテスト信頼性は、FM：ICC = 0.98, SEM = 0.85 kg; LM：ICC = 0.99, SEM = 1.07 kg; % fat：ICC = 0.98, SEM = 1.0% であった。
最大筋力テスト
標準的な吸収後の状態で、各参加者は、この研究室で以前使用した標準ガイドラインに従って、フリーウェイトとスポッターを使用してベンチプレスとレッグプレスの1反復最大（RM）筋力テストを実施した。 5分間のウォームアップと軽いストレッチの後、参加者は器具と動作に慣れるようにした。 その後、各参加者は、予測1RMの50%で8～10回反復した。 1分間の休息後、各参加者は、予測1RMの80%で4～6回の反復運動を行った。 1分間の休息後、重量を推定1RMの負荷まで増加させ、参加者はこれを1回持ち上げる。 各セット1回の反復に成功した後、4回以内で失敗するまで重量を増加させた。 1RMの試行の間には、2～3分の休息が与えられた。
1RMテストの後、参加者は、4つの付属運動である交互の静止ランジ、オーバーヘッド肩プレス、二頭筋カール、オーバーヘッド三頭筋伸展について、複数RM強度テストを実施した。 参加者は、フリーウェイトとスポッターを使用し、各運動を3回以上10回以下の反復で1セット持ち上げることができる重量で実施した。 各エクササイズの重量は、実験室のアシスタントが、各参加者の過去の筋力トレーニングの経験に基づいて設定した。 参加者が3回反復できない場合、または10回以上反復できる場合は、それぞれ重量を減らし、または増やし、テストをやり直した。 各運動間には2～3分間の休息を与えた。
筋力テストから得られた多重RMは、以下の式を用いてアクセサリーエクササイズの1RMを推定するために使用された：
すべてのエクササイズについて参加者の1RMが決定されると、HIRTセッションで使用される6RM～8RMについては80％～85％が算出されました。
エネルギー摂取評価
すべての参加者は、通常の栄養摂取量を評価するために、ベースラインの3日間の食事記録に記入した。 参加者は食品の分量について教育を受け、同様の多量栄養素プロファイルを促進するために、各運動セッションの前日に同様の食事をするよう求められた。 栄養摂取量は、栄養学ソフトウェアプログラム（The Food Processor, version 10.12.0, Esha Research, Salem, OR, USA）を用いて分析された。 平均して、被験者は1日あたり2,078.7 ± 679.9 kcal、253.7 ± 97.6 g CHO（約48.8％のCHO）、84.3 ± 29.9 g PRO（約16.2％のPRO）、80.9 ± 36.7 gの脂肪（約35％の脂肪）を摂取していた
Saliva collection and analysis
考えられるエネルギー基盤利用におけるエクササイズセット間の差を考慮し、エストラジオールが測定された。 エストラジオール濃度は、唾液エストラジオール-β-17（エストロゲン）のELISAアッセイ（Salivary 17β-Estradiol Enzyme Immunoassay Kit, Salimetrics, LLC, State College, PA, USA）を使用して、各運動試合の前に2.5～5.0mLの唾液試料で測定された。 唾液採取結果の妥当性を確保するため、参加者は唾液サンプル提供の3時間前から12時間の飲酒と主食の摂取を控えるよう求められた。 唾液採取の10分前に水で口をすすぎ、食物残渣を除去するよう参加者に求めた。 唾液中の血液を避けるため、参加者は唾液採取の48時間前から45分間歯磨きと歯科治療を避けるよう求められた。 すべてのサンプルは、-20℃で凍結する前に、必要以上に4℃で維持された。 エストロゲンのアッセイ内精度変動係数（CV）は8.7％〜18.6％、アッセイ間精度変動係数は3.9％であった。 女性におけるエストラジオールβ-17のエネルギー基質利用に対する生理的役割から、ベースラインのエストラジオールレベルは、REEおよびRERの解析において共変量として使用された。 コルチゾール濃度は、唾液コルチゾールのELISAアッセイ（Salivary Cortisol Enzyme Immunoassay Kit, Salimetrics, LLC, State College, PA, USA）を用いて、各運動試合の前と後に2.5～5.0mLの唾液サンプルで測定され、収集と保管については前述のプロトコルが使用された。 すべてのサンプルが収集されると、治療とは無関係に、コルチゾールに対する各モダリティの効果を決定するために、運動前と運動後のサンプルを作成するために、2つのサプリメント間でより小さなサブサンプルがプールされた。 コルチゾールのアッセイ内精度CVは12.0％～17.1％、アッセイ間精度CVは4.9％であった。
栄養介入
唾液サンプルを提供した後、各運動セッションを開始する直前に、二重盲検法により、参加者は25gのCHO（マルトデキストリン）またはPRO（乳清分離物；Elite Whey Protein Isolate, Dymatize Nutrition, Farmers Branch, TX, USA）を不透明な瓶に入った水6オンスと混合し経口的に摂取した。 治療順序は、無作為割付ソフトウェアを用いて無作為に割り付けた。 CONSORTガイドラインに従い、栄養製品は実験室に到着する前に会社によって盲検化された。 7179>
有酸素持久運動（AEE）
有酸素運動は、自己選択による5分間のウォームアップと、45％～55％のHRRでの30分間のトレッドミル（Q65 Series 90, Quinton Instrument Co, Seattle, WA, USA）ジョギングから構成されていた。 7179>
High-intensity interval running (HIIT)
HIITは、自分で選択した5分間のウォームアップと、85%から95%のHRRでの60秒間のトレッドミル走、60秒間の受動的休息から構成された。 全運動時間は約20分であった。 RPEを記録し、各インターバルの終了時にHRを測定した。統計解析には、10回の60秒運動インターバルの平均値を用いた。
高強度抵抗トレーニング（HIRT）
強度評価から得られたデータは、HIRTセッションの適切な重量負荷を決定するために使用された。 運動は、フリーウェイトを用いたレッグプレスとベンチプレス（York Barbell Co.、York、PA、USA）、ランジ、ショルダープレス、バイセップスカール、トライセップスエクステンションの順で行った。 被験者は、開始前に自己選択したウォームアップを行った。 HIRTは、6RMから8RMの運動を3セット行い、その後20秒から30秒の休息をとるというものであった。 各運動間の休息時間は2.5分であった。 HIRTセッションの平均時間は約25分であった。 HRは各セット終了時に測定し、RPEは各運動終了時に記録した。統計解析には、6つの運動の各HRとRPEの平均値を用いた。
代謝測定
FREEとRERは、代謝カートと内蔵ソフトウェア（TrueOne 2400, ParvoMedics, Inc.） 酸素摂取量（VO2）および二酸化炭素生成量（VCO2）の間接的評価を測定し、以下の式でREEおよびRERをそれぞれ算出した：
ガス分析は、各運動セッションの直前にマウスピースとホースを介して行われた。 を 15 分間行い、安静時の測定値を取得した（ベース）。 運動終了後すぐに、参加者は着席し、15分間メタボリックカートに再接続し、運動直後（IP）の測定値を取得した。 その後、参加者はカートから離脱し、静かに着席したままとした。 測定は、25分から35分（30分）および50分から60分（60分）の間に再度行われた。
統計解析
唾液エストラジオールとコルチゾールレベルにおけるベースラインの差を調べるため、一元配置反復測定ANOVAが実施された。 共分散分析（ANCOVA）混合効果線形モデルを用いて、REEとRERの平均的な縦断的変化を比較した。 最初のモデルには、栄養処置（CHO vs. PRO）、運動様式（AEE vs. HIIT vs. HIRT）、時間（ベースライン vs. IP vs. 30分 vs. 60分）、2方向および3方向の相互作用、ならびにベースラインの唾液エストラジオールレベルの固定効果を含めた。 三元交互作用は最初に検定され、有意でない場合は三元交互作用を除いた縮小モデルが適合された。 次に、複数の自由度対比を用いて、栄養学的介入または運動様式間の経時的な差の証拠を検証した。 これらの全体的な対比が有意であった場合にのみ、一対の比較が行われた。 ベースラインの差を共分散させたコルチゾールの変化についてANCOVAが実施された。 反復測定ANOVAは、モダリティにおけるHRおよびRPEの差異について実施された。 統計解析にはSPSS version 20 (IBM; Armonk, NY, USA)を使用した。 すべての検定は5％有意水準で実施した
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