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連鎖球菌はヒトの口腔内に最も多く生息しており（6，24），日常活動で生じた歯周病変や口腔内の擦り傷を通じて血流に頻繁に到達する（32）． これは、感染性心内膜炎（IE）（28）や好中球減少性菌血症（29）などの重篤な疾病につながる可能性がある。 口腔内連鎖球菌の分類は、長い間混乱の原因となってきた(4, 9, 20, 22, 31)。 しかし、この方法では、Streptococcus mitisやStreptococcus oralisなどの近縁種を区別したり(12)、種内の菌株タイピングや系統解析を行うのに必要な感度に欠ける。 そこで、16S-23S rRNA遺伝子間転写スペーサー（ITS）（2）、タンパク質をコードするハウスキーピング遺伝子（1、5、7、10、12、14、15、19、23）、またはその両方（17、18）など、より多様性を有する遺伝子が検討されてきた。 これらの目的に最も適した遺伝子に関するコンセンサスはまだ得られていない。 さらに、これまでの研究では、臨床血液培養から口腔内連鎖球菌を確定的な配列決定法で同定しているが（12、23、30）、基礎疾患に関する詳細な臨床情報を報告したものはない。 2003年5月から2008年5月までにVirginia Commonwealth University Medical Center Hospitalで実施された血流培養は，臨床微生物学研究室によって連鎖球菌を含むと推定された． コンピュータスクリプトを用いて非口腔内細菌種を除外した。 汚染物質の分析を避けるため、同一患者の別々の培養物から2つ以上の報告があった場合のみ、分離プレートを要求した。 各単離プレートから1コロニーをブロス培養で増殖させ、マクロおよびミクロの観点から検査した。 同じ患者から採取した別々の培養液で何らかの違いが観察された場合、両方の培養液が保管された。

各単離株の種の同一性と系統的関連性を決定するために、16S-23S ITSを、以前に記述した6Rと13BFプライマーを用いて増幅した(2)。 いくつかの分離株から産物が得られなかったとき、6Rプライマーの最後の3塩基がGenBankのいくつかの対象種の23S rRNA配列と一致しないことに注目した。 そこで、6Rプライマーを短縮して6R-Sとし、13BFプライマーを短縮してそのアニーリング温度を合わせた（補足資料の表S1参照）。 6Rプライマーの同様の改変は最近報告されている(18)。 これらのプライマーを用いて、すべての分離株からPCRアンプリコンを得、キャピラリーDNA配列解析に供した。

ほとんどのDNA配列には完全なITSと16Sおよび23S rRNA遺伝子の一部が含まれており、GenBankで入手できるタイプ株のITS配列と整列するか、American Type Culture Collection (ATCC) から得た菌株を用いて私たちが決定したものであった。 その結果、16Sおよび23Sの隣接配列は、ほとんどの公開配列では保持されていないものの、ITSのアライメントを容易にすることがわかった。 実際、16S rRNA遺伝子の3末端から78bp前に位置するCTAAGGが、ITSの始まりと定義された同一のヘキサヌクレオチド配列と混同されているタイプ株の配列が少なくとも4つ発表されている(18)。 次に、トリミングしたITS配列（2）をMEGA 4ソフトウェア（25）で比較・整列し、近傍結合系統樹（図1）を構築した。

近縁種のS. mitisとS. oralisを含む口腔内連鎖球菌の種の同定には，ITS解析だけで十分であることが以前から示唆されている． S. oralisは2カ所の一塩基欠失と246 bpのITSを持ち，S. mitisは欠失を持たず248から249 bpのITSを持つとされた（2，3）． 本研究では、両種とも欠失を持つ株と持たない株が存在し、ITSの長さも重なっていた。 したがって、S. oralisとS. mitisの分離株は、これらの基準では信頼性の高い区別ができない。 また，別の研究により，ITS配列解析はS. oralisとS. mitisの識別には不十分であるが，anginosus groupに属するものを含む他の多くの口腔内連鎖球菌の識別には十分であることが示唆されている(18)． しかし，ginosus群に属するS. intermedius (VMC38) の1株はITSで分類できなかった（補足資料の表S1参照）．

特にS. mitisとStreptococcus constellatusについても多くの分離株が同一の配列を有しており，系統解析は不可能である． また、同じ患者から分離された5組の分離株からも同一配列が得られた（データなし）。

ITS解析では不十分であったため、第二の共通標的であるマンガン依存性スーパーオキシドディスムターゼをコードするsodA遺伝子の配列を決定した（1、5、10、12、14、19、27）。 これにより、いくつかの分離株を除外することができた。 同一人物由来でITS配列が同一である上記の菌株ペアは、sodA配列も同一であり、同一株であることが確認され、各ペアから1株ずつを除外することができた。 また、2株は明らかな株の取り違えで、もう1株はITS配列とsodA配列からEnterococcus faecalisの株であることが判明し、保持されなかった。 残りの菌株から得られた系統樹を図1に示す。

系統解析の結果、sodA配列はITS配列よりも優れていた。 同一のsodA配列を持つ分離株はS. mitisの2株とStreptococcus vestibularisの2株だけであった。 また、sodAアラインメントは、種の決定にもより有用であった。 すべての参照株は、系統樹において互いによく分離されていた。 その結果、ITSでは15種であったのに対し、sodAではわずか4種の曖昧な種割り当てにとどまった（補足資料の表S1参照）。 ITSとsodA配列の両方で1つの種の指定が一貫していた場合は、その指定が使用された。 最終的に58の臨床分離株のうち、この方法で確信を持って同定できなかったのは3つだけであった。 VMC1 と VMC43 は何度も塩基配列の決定を試みたが、ITS 配列が短すぎて情報が得られず、VMC58 は ITS と sodA 配列が一致しなかった (図 1; 表 S1)． これらの分離株について、最近公開されたsodA, pfl, pykを含む420のstreptococcal strainから得た7つのハウスキーピング遺伝子の配列を含むデータベースを用いて、種同定を行った(1)。 すべての菌株のpflおよびpyk遺伝子の塩基配列を決定し、既存のsodAと同様にeMLSA.netデータベース（http://www.emlsa.net/）の塩基配列とアライメントした。 すべての場合において、pflおよびpykの種差はsodAからの種差と一致した。 さらに、sodAによるアラインメントは、VMC58の配列が、型番株とは乖離しているものの、データベース中の13のStreptococcus infantis分離株のクラスターに含まれることを示した（データは示されていない）。 本研究に含まれる全分離株のコンセンサス種同定を図1、補足資料の表S1、S2に示す。

これらの結果は、sodA解析だけでほとんどの株を同定できることを示唆しているが、我々はすべての株について少なくとも1つのタンパク質をコードするハウスキーピング遺伝子を追加することを推奨している。 多くの口腔内連鎖球菌は天然にコンピテントであり，sodAを含む外来ハウスキーピング遺伝子を獲得した例が報告されている（1，12）． 本研究では、これは明らかではなかったが、ITS (VMC38, VMC50) と sodA (VMC33) のキメラ配列の例があった。 最近発表された2つの論文では、さらに踏み込んで、7つのハウスキーピング遺伝子の異なるセットを配列決定し、多座配列タイピング（7）または多座配列解析（1）することが提案されている。 これらのアプローチは、より多くの遺伝子を解析することにより、分解能を高め、時折生じるキメラ遺伝子や外来遺伝子の影響を最小限に抑えるものである(1, 7)。 また、これらの手法では、2〜3個の遺伝子で行うよりも高度な系統解析が可能である。 しかし、pflとpykの増幅と配列決定が困難な場合があり、他の2つの推奨遺伝子、mapとppaCではほとんど成功しなかった(1)。 最近の別の研究でも、同様の困難が報告されている(27)。 このように、追加遺伝子の選択には経験的な検証が必要であるが、7遺伝子解析で採用された遺伝子は、よく特徴付けられた菌株の配列の大規模なコレクションが比較のために利用できるので、最初に検討されるべきである（1、7）＜9533＞＜1436＞我々の知る限り、Streptococcus australis (12) または S. infantis (30) 血液培養分離株の報告は2件目であった。 後者については、嚢胞性線維症の成人の喀痰から分離されたという2件の報告があるのみである(17, 26)。 したがって，今回のS. infantis分離株VMC58が嚢胞性線維症の成人から分離されたことは興味深い（補足資料の表S2参照）。 表S2には、感染源となった患者の臨床データおよび人口統計学的データも示しており、主な基礎疾患（内科疾患、悪性腫瘍、IE、手術／外傷）に基づいて分類している。 すべてのIE患者は臨床的に診断され、VMC56のケース（表S2）以外は修正Duke基準（16）により「確定的IE」と分類された。 唯一の例外は、過去にIEと静注薬物使用（IVDU）の既往があり、血液培養の陽性と合わせて「IEの可能性」と分類された。 中心静脈ライン、消化器内視鏡検査、口腔粘膜炎、歯科疾患、IVDUなどの感染源となりうるデータも調査された。 IVDUは13人のIE患者のうち9人に認められ、他の患者には1人しか認められなかった（表S2）。 この差は統計的に有意であった（P < 0.0001; Fisherの正確検定）。 したがって、本研究は口腔内の菌種に焦点を当てたものであるが、IVDUは圧倒的な危険因子であった。

我々の系統的分析では、特定の菌種またはクローン型と基礎疾患や白血球数、最高温度、植生サイズ、影響を受けた弁、患者の死亡など他の臨床パラメータとの統計的に有意な関連は明らかにされなかった。 ある先行研究では、好中球減少症患者から分離された菌種を特定するのに十分な情報が含まれていた(12)。 その研究では12株中11株が、我々の研究では10株中9株がS. mitisまたは近縁種のS. oralisであり、結果は同様であった（Table S2）。 我々の研究では、これら2つの種を合わせると、残りの12種を合わせたよりも好中球減少症患者から分離される可能性が有意に高かった（P = 0.004; Fisherの正確検定）。 これは口腔内におけるこれらの種の有病率を反映していると思われる。 しかし、この傾向がIEに引き継がれなかったのは興味深いことである。 好中球減少症とIEに関する我々のデータと同じ研究（12）のデータを合わせると、S. oralisとS. mitisは好中球減少症22例中20例から分離され、IE27例中15例からのみ分離され、その差は統計的に有意だった（P = 0.01; Fisherの正確さの検定）。 以前の研究（11, 12, 30）と同様に、サンプル数の関係から、菌種と特定の病気や臨床的特徴の間に考えられる他の関連性を確信を持って評価することはできなかった。 しかし、各患者の臨床的および人口統計学的特徴と確定的な種の同定を組み合わせることにより（表S2）、我々は、メタ分析または複合データを利用する他の研究に適した結果になるように努めた。

本研究で決定したタイプ株と臨床分離株のDNA配列は、GenBankにアクセッション番号JN181256からJN181394で寄託された。 Baylor College of MedicineでHuman Microbiome Projectのために決定されたS. sanguinis分離株VMC66の全ゲノムショットガン配列（S. K. Highlanderら、未発表データ）はGenBank accession number NZ_AEVH01000000.

で利用可能である。