ウイルスのクローン集団を精製するため、あるいはウイルスの力価をプラーク形成単位/ml（pfu/ml）として測定するために使用し、その後の作業で既知のウイルス量を用いて細胞感染させることができます。 このアッセイでは、細胞単層は散発的な細胞が感染するような低い比率のウイルスで感染させる。 アガロースで覆われているため、細胞は安定に保たれ、ウイルスの拡散を抑えることができる。 感染した各細胞がウイルスを産生し、最終的に溶解すると、すぐ隣の細胞のみが感染する。 感染した細胞の各グループはプラークと呼ばれる。 感染していない細胞はプラークを取り囲んでいる。 数回の感染サイクルの後、プラークの中心にある感染細胞は溶解し始め、周辺の感染細胞は非感染細胞に囲まれたままである。 この現象により、感染細胞を通過した光は周囲の非感染細胞とは異なる屈折を示し、プラークを肉眼または光学顕微鏡で可視化することができる。 各プラークは1つのウイルスを表している。 従って、個々のプラークを分離することにより、クローン性ウイルス集団を精製することができる。 ウイルスストックの様々な希釈液から得られた個々のプラークを数え、所定のトランスフェクションまたはウイルスストックのウイルス力価（pfu/ml）を決定することができる。 プラークアッセイの成功には、細胞の状態と組織培養プレートの表面への均一な分布が重要である。 細胞は健康で、95％以上生存しており、アッセイ時に対数増殖期であることが望ましい。
必要な追加材料：
Plaque Assay Agarose, Cat. 554766
Grace’s Unsupplemented Insect Cell Medium
Fetal Bovine Serum
Tissue Culture Dish, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat.No. 353802
42°C water bath
Protocol
必要なプレート枚数の決定
各共同感染またはウイルスストック（および陽性コントロール）について、連続希釈（10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ）を2枚ずつ行う。
昆虫細胞を培養プレートに播種する
- 60mmプレートに2.3 x 10 6 Sf9細胞を播種する。 プレートを前後左右にゆっくりと揺すり、細胞をプレート表面に均等に分散させる。 決してプレートを振り回さないでください。 プレートを播種後、30 分から 1 時間、細胞を付着させる。 この間に、寒天培地やウイルスの希釈液を調製する。
アガロース溶液の調製
プレーティングした細胞に、10%FBS添加グレース昆虫培地で1%アガロース溶液を重層する。
- まず、ウォーターバスを42℃に平衡化させる。 必要な寒天培地の量は、4ml/plate にプラークアッセイの回数を乗じて算出する。 この総量のうち、半分はオートクレーブしたdH 2 O + アガロースで2%溶液とし、残りの半分は10%FBS添加のGrace’s Insect Mediaとする。 最終的な 1%アガロース溶液に必要なプラークアッセイ用アガロースの量（グラム）は、総容量に 0.01 を乗じ て求める。 (例：プレート10枚×4ml＝40ml 40ml X 0.01＝0.4gm)
- 適切なサイズの滅菌ガラス瓶にオートクレーブしたdH2 Oを適量入れます。 次に、dH 2 Oとアガロースが混ざるように静かに振りながら、計算された量のアガロースをゆっくりと加えます。 この混合物を電子レンジで沸騰するまで加熱する。 瓶を取り出し、アガロースが溶けていないかどうか確認する。 もしあれば、加熱を継続する。 アガロースが完全に溶解するまで繰り返す（注意：混合物や付随する蒸気は非常に高温で、火傷の恐れがあります。 適切な安全装置や予防策を使用すること）。 アガロースが完全に溶解したら、ボトルのキャップを緩め、42℃の水槽に移す。
- Grace’s Insect Mediaを入手し、Fetal Bovine Serumを10%になるように添加する。 例：Grace’s Insect Media 100 ml に対して、FBS を 10 ml 添加。
ウイルス連続希釈液の調製
- 各共同感染について、10 -1～10 -6までの15 ml滅菌チューブ6本に適切なサンプル説明をラベルしてください。 各チューブに2.7 mlのTNM-FH培地を加える。 最初のチューブに0.3 mlの共導入上清を加え、チューブをボルテックスする。
単層細胞への感染
- この時点で、細胞はプレート表面に接着するのに十分な時間がありました。
- 各希釈倍率のプレートを複製し、滅菌済み200μlピペットチップと真空吸引器を用いて、細胞から培地を注意深く吸引除去します。 細胞シートは破砕しないでください。 各プレートに1mlのウイルス希釈液を加え、プレートを前後左右に軽く揺すって、ウイルスを均等に分散させる。
- 室温で、15分おきに滅菌フード内でプレートを静かに揺すること1時間。
感染細胞をアガロースで重ねる
- 1時間後、アガロース溶液が42℃であることを確認する。 溶液はまだ液体の状態であるが、手で持てる程度に冷えていることが望ましい。 もし、手で持てないようであれば、溶液が熱すぎてSf9細胞は死んでしまう。 Grace’s Insect Media w/ 10% FBSが42℃であることを確認する。 その場合、アガロース溶液に等量加えて、最終的な寒天溶液を完成させる。
- 準備ができたら、ウォーターバスの水を張ったガラスビーカーに入れ、よく混ぜ合わせます。 これで、フード下で使用する間、溶液が固まるのを防ぐことができるはずです。 手順の間、定期的にビーカー内の水の温度を確認します。
- 一度に1組の複製を使用し、滅菌した200μlのピペットチップと真空を使用して、細胞から慎重に培地を吸い取ります。 細胞シートは壊さないようにしてください。 吸引中、プレートを少し傾け、プレートの端から上清を吸引する。 これにより、細胞シートを乱すことなく、最適な吸引を行うことができます。 その後、各プレートに4mlの寒天液をゆっくりと加え、寒天を固化させる。
- すべてのプレートの寒天が固化したら、プレートを清潔な密閉培養槽に注意深く置く。 10mm培養皿に滅菌ガーゼと滅菌水10mlを入れ、インキュベーションチャンバーの底の棚に置き、チャンバーを加湿する。 チャンバーを密閉し、27℃のインキュベーターに入れる。
- プラークは、暗い背景の上でプレートを反転させ、プレートの側面から強い光源で照らすか、光源に対して45°の角度で保持すると、視覚化することができます。 プラークの見分け方を学ぶときは、可能性のあるプラークをマーカーで丸く囲む。 光学顕微鏡で低倍率で観察し、細胞の芝生の中に透明な領域があることを確認する。
- プラークの視覚化を容易にするために、50μg/mlのニュートラルレッドを含む3mlの0.5％アガロース（前述のように調製）でオーバーレイする。 水またはPBSで1mg/mlのニュートラルレッド（Sigma N7005）ストック溶液を調製しておく）。 ろ過滅菌し、4℃、暗所に保存する)。 固化させ、27℃で一晩インキュベートする。 ニュートラルレッドは健康な細胞を染め、プラークは白地に直径約0.5～3mmの透明な領域として現れる。 ニュートラルレッドは重要な色素なので、細胞単層が健康なうちに染色することが重要です。
ウイルスストックからのプラークの精製
適切に分離するには、プラークを50個以下のプレートから採取することが最善です。 十分に少ない数のプラークが得られるように、ウイルスのいくつかの希釈液をプレートしてください。
Amplify Virus from Plaque Pickup
- Marker with the plate under the plaque is a marker.プラークをピックアップする際、滅菌済みマイクロピペットチップ（1000μl）またはマイクロキャピラリーチューブを使用するとよい。 滅菌済みピペットチップを使用して、プラークの真上のアガロースプラグを除去します。
- 各アガロースプラグを、1mlの組織培養液の入った別の微量遠心管に入れる。
- 各プラークの200μlを、1mlの新鮮なTNM-FH培地に2 x 10 5 cells per wellで播種した12ウェル組織培養プレートの別々のウェルに添加する。 27℃で3日間インキュベートする。
- この通過1ストックのウイルス上清を集め、4℃で1,000 x g、5分間遠心分離して破片を除去することができる。 4℃で保存する。
- 100mm組織培養プレートに、各プラークについて5 x 10 6 cellsを播種する。
- 100mmプレートに200μlの継代ストックを加え、27℃、4日間培養する。 残りの800μlのpass-oneストックはバックアップとして4℃で保存します。
- ウイルス上清を採取し、遠心分離して残骸を除去します。 このpassage-2ストックの力価を測定する。 2 x 10 8 pfu/ml以下の場合は、Baculovirus Amplificationに進みます。