dNTPとはデオキシリボースヌクレオチド三リン酸のことで、PCRで使用されるdNTPとしてはdATP、dTTP、dGTP、dTTPが一般的である
PCRにおけるdNTPの機能としてはTaq DNA polymeraseにより伸張しているDNA鎖を伸ばすことである。 これは、水素結合によって相補的なDNA鎖と結合する。
PCRは、DNA合成のin vitro技術である。 PCRを行う目的は、目的のDNA断片を複数コピーし、ゲル電気泳動で可視化することである。
PCRの目的は、DNA配列決定やDNAマイクロアレイのような様々な下流のアプリケーションのために、何百万ものDNAコピーを作ることです。
ポリメラーゼ連鎖反応は、その発見以来分子遺伝学研究に使用されている比類のないツールです。 DNAテンプレート、プライマー、バッファー、Taq DNAポリメラーゼ、dNTPsがPCRの材料である。 このPCRの仕組みを理解するためには、そこで使われるすべての成分の重要性を知る必要があります。
今回は、PCRの主要成分の1つであるdNTPについて説明します。 また、その構造やなぜ重要なのかについても見ていきたいと思います。
さらに、dNTPとTaq DNAポリメラーゼが相互作用し、成長するDNA鎖に働きかけるメカニズムについてもお話しします。
PCR関連記事、
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Key Topics:
What are dNTPs?
dNTPはデオキシリボースヌクレオチド三リン酸を意味する。
dNTPを理解するためには、まず、塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドなどの基本用語を理解しておく必要がある。 これらは遺伝学で日常的に使われる基本的な用語ですが、それでも誤解されることがあります。
アデニンとグアニンはプリン塩基で、シトシンとチミンはピリミジン塩基です。 窒素塩基は直接DNAを形成することができません。 また、リン酸塩基と五炭糖もDNAを形成するために必要です。
ヌクレオチドは五炭糖、リン酸、窒素塩基から構成されている。
画像はデオキシリボース三リン酸、二リン酸、一リン酸の構造を表しています。
「DNAの構造」の続きを読む DNAの話。 DNAの構造と機能
ヌクレオチドに存在するリン酸は三リン酸で、リン酸がヌクレオチドと結合していない（ない）場合はヌクレオシドと呼ばれます（リン酸のないヌクレオチドはヌクレオシドと呼ばれる）
五価糖で水酸基に代わって水素原子があると、デオキシ糖と呼ばれます。 DNAはデオキシ五炭糖からなり、RNAはリボース糖のみからなる。
dNTPは、リボース、窒素塩基、リン酸からなるヌクレオチドの鎖である。
ジデオキシヌクレオチド三リン酸は、フリーの3’OH基を持たず、糖の3′OH基が水素に置換されている。
そのため、成長中のDNA鎖の拡張を引き起こすことができません。 そこで、DNAの塩基配列決定には、このようなddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTPが使われるのです。
画像はリボース糖、デオキシリボース糖、デオキシリボース糖の違いを表しています。
三リン酸は3種類のリン酸分子で構成されていて、DNAにバックボーンを提供する。
DNAのリン酸骨格には、α、β、γリン酸という3つの異なるリン酸分子があります。 同様に、3つのリン酸のうち2つが放出されると、その構造はデオキシヌクレオチド一リン酸として呼ばれるようになります。
dATPとdGTPはプリン系、dCTPとdTTPはピリミジン系のdNTPで、PCR反応に使用されます。 PCRにおけるdNTPの働きは、生体内複製と同じである。 ヌクレオチドとヌクレオシドの違い、プリンとピリミジンの違いについて興味のある方は、以下の記事を読んでみてください。
- Purines Vs Pyrimidines
- Nucleotides Vs Nucleosides
画像は4種類のdNTPの構造です
dNTPの機能。
dNTPは、PCR、RT-PCR、DNAシークエンス、DNAマイクロアレイの原料で、DNAの増殖やDNAの増幅を助けています。
PCRのプロセスは、温度に依存する3つのステップに分けられます。
- 変性
- アニーリング
- 伸長。
変性ステップでは、二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性させる。アニーリングステップでは、プライマーがその相補配列が存在する位置に正確に結合し、
伸長ステップでは、Taq DNAポリメラーゼが成長するDNA鎖でdNTPを付加させる。
鎖が開き、プライマーが一本鎖DNAと結合すると、Taq DNAポリメラーゼは酵素活性の基質として、プライマーとDNAの接合部に沈着する。
TaqDNAポリメラーゼの一端はオリゴヌクレオチドプライマーの3’OH基付近に結合し、この複合体はP-DNA複合体と呼ばれる。
図は、DNAの水素結合とホスホジエステル結合の構造を表しています。
次のステップでは、dNTPの添加を開始します。 その直後にTaq DNAポリメラーゼがそれを保持し、相補的な塩基とdNTPの間に水素結合の相互作用が起こる。
まず、鋳型となるssDNA上に相補的な塩基（TにはA、CにはG）を見つけると、それらの間に水素結合を形成する。
一旦水素結合が形成されると、Taq DNAポリメラーゼはホスホジエステル結合を形成して、dNTPの結合を成長するDNA鎖に適合させる。 ホスホジエステル結合の形成後、Taq DNAポリメラーゼは新しいdNTPを追加するために一歩先に進みます。
ホスホジエステル結合は、プライマーの3’OHとdNTPの5’Pの間に形成されます。
水素結合が形成されると、Taq DNAポリメラーゼはdNTPの3リン酸からガンマとベータリン酸を除去して反応を触媒する。 反応終了後、2つのピロリン酸(PPi)が放出されます。
PCR反応中にdNTPとTaqポリメラーゼがどのように相互作用するかの正確なキネティクスはまだわかっていない。
アガロースゲル電気泳動について
- アガロースゲル電気泳動
- DNA gel loading dye
- Role of EtBr in agarose gel electrophoresis
PCRでのdNTPs濃度について
。
一般に、30～35サイクルのPCR反応では、各dNTPは200μMもあれば十分である。
各200μM、つまり4つのdNTPs mixで合計800μMを1回のPCR反応に使用することになります。 このため、100mMのストック溶液から作業濃度を調製する必要があります。
しかし、最近ではReady to useのマスターミックスが人気で、効果的です。 マスターミックスには、dNTPs mix、ゲルローディング色素、Taq DNA polymeraseなど、重要な成分がすべて含まれています。
理系の学生である私たちは、ストックからどのように作業溶液を調製するかに頭を悩ませています。
さて、
V1C1=V2C2を覚えていますか？
ここで、与えられた濃度C1は100mM（dNTPsのストック濃度）
V1は与えられた体積が未知（？)
C2は必要な濃度=2mM
V2は必要な体積=1000μL
ここでV1C1=V2C2
V1=V2C2/ C1
V1=1000×2/ 100
V1=20μL
ここで、。 作業液の調製に必要なdNTPはそれぞれ20μLなので、最終的には920μLのD/Wに80μLの（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）を混合することになります。
これにより、各dNTPの最終濃度は、1000μLのワーキングソリューションで2mMとなります。 200μMは自分で計算してください。
私のPCRにおけるdNTP使用法
必ずストック溶液を2本用意し、すべて-20℃に保存してください。
1週間に行う反応数を計算し、それに合わせてストックからワーキング溶液を調製し、4℃で保存してください。 凍結融解を繰り返すと、dNTPの活性が低下するため。
外来DNAの混入はPCR反応の妨げになりますので、作業溶液の調製時には必ずグローを装着し、無菌状態を維持してください。
dNTPの濃度は200μMで十分ですが、Long-range PCRでは2mMから3mMのdNTPを使用することができます。
dNTPの濃度が高くなると、非特異的結合の割合が増加する。 同様に、dNTPが不足するとPCR産物が不完全になる。 したがって、常に適切な量のdNTPsを使用する必要があります。
dNTPはデオキシリボースヌクレオチド三リン酸を意味する。
dNTPを理解するためには、まず、塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチドなどの基本用語を理解しておく必要がある。 これらは遺伝学で日常的に使われる基本的な用語ですが、それでも誤解されることがあります。
アデニンとグアニンはプリン塩基で、シトシンとチミンはピリミジン塩基です。 窒素塩基は直接DNAを形成することができません。 また、リン酸塩基と五炭糖もDNAを形成するために必要です。
ヌクレオチドは五炭糖、リン酸、窒素塩基から構成されている。
画像はデオキシリボース三リン酸、二リン酸、一リン酸の構造を表しています。
「DNAの構造」の続きを読む DNAの話。 DNAの構造と機能
ヌクレオチドに存在するリン酸は三リン酸で、リン酸がヌクレオチドと結合していない（ない）場合はヌクレオシドと呼ばれます（リン酸のないヌクレオチドはヌクレオシドと呼ばれる）
五価糖で水酸基に代わって水素原子があると、デオキシ糖と呼ばれます。 DNAはデオキシ五炭糖からなり、RNAはリボース糖のみからなる。
dNTPは、リボース、窒素塩基、リン酸からなるヌクレオチドの鎖である。
ジデオキシヌクレオチド三リン酸は、フリーの3’OH基を持たず、糖の3′OH基が水素に置換されている。
そのため、成長中のDNA鎖の拡張を引き起こすことができません。 そこで、DNAの塩基配列決定には、このようなddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTPが使われるのです。
画像はリボース糖、デオキシリボース糖、デオキシリボース糖の違いを表しています。 三リン酸は3種類のリン酸分子で構成されていて、DNAにバックボーンを提供する。
DNAのリン酸骨格には、α、β、γリン酸という3つの異なるリン酸分子があります。 同様に、3つのリン酸のうち2つが放出されると、その構造はデオキシヌクレオチド一リン酸として呼ばれるようになります。
dATPとdGTPはプリン系、dCTPとdTTPはピリミジン系のdNTPで、PCR反応に使用されます。 PCRにおけるdNTPの働きは、生体内複製と同じである。 ヌクレオチドとヌクレオシドの違い、プリンとピリミジンの違いについて興味のある方は、以下の記事を読んでみてください。
- Purines Vs Pyrimidines
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画像は4種類のdNTPの構造です
dNTPの機能。
dNTPは、PCR、RT-PCR、DNAシークエンス、DNAマイクロアレイの原料で、DNAの増殖やDNAの増幅を助けています。
PCRのプロセスは、温度に依存する3つのステップに分けられます。
- 変性
- アニーリング
- 伸長。
変性ステップでは、二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性させる。アニーリングステップでは、プライマーがその相補配列が存在する位置に正確に結合し、
伸長ステップでは、Taq DNAポリメラーゼが成長するDNA鎖でdNTPを付加させる。
鎖が開き、プライマーが一本鎖DNAと結合すると、Taq DNAポリメラーゼは酵素活性の基質として、プライマーとDNAの接合部に沈着する。
TaqDNAポリメラーゼの一端はオリゴヌクレオチドプライマーの3’OH基付近に結合し、この複合体はP-DNA複合体と呼ばれる。
図は、DNAの水素結合とホスホジエステル結合の構造を表しています。
次のステップでは、dNTPの添加を開始します。 その直後にTaq DNAポリメラーゼがそれを保持し、相補的な塩基とdNTPの間に水素結合の相互作用が起こる。
まず、鋳型となるssDNA上に相補的な塩基（TにはA、CにはG）を見つけると、それらの間に水素結合を形成する。
一旦水素結合が形成されると、Taq DNAポリメラーゼはホスホジエステル結合を形成して、dNTPの結合を成長するDNA鎖に適合させる。 ホスホジエステル結合の形成後、Taq DNAポリメラーゼは新しいdNTPを追加するために一歩先に進みます。
ホスホジエステル結合は、プライマーの3’OHとdNTPの5’Pの間に形成されます。
水素結合が形成されると、Taq DNAポリメラーゼはdNTPの3リン酸からガンマとベータリン酸を除去して反応を触媒する。 反応終了後、2つのピロリン酸(PPi)が放出されます。
PCR反応中にdNTPとTaqポリメラーゼがどのように相互作用するかの正確なキネティクスはまだわかっていない。
アガロースゲル電気泳動について
- アガロースゲル電気泳動
- DNA gel loading dye
- Role of EtBr in agarose gel electrophoresis
PCRでのdNTPs濃度について
。
一般に、30～35サイクルのPCR反応では、各dNTPは200μMもあれば十分である。
各200μM、つまり4つのdNTPs mixで合計800μMを1回のPCR反応に使用することになります。 このため、100mMのストック溶液から作業濃度を調製する必要があります。
しかし、最近ではReady to useのマスターミックスが人気で、効果的です。 マスターミックスには、dNTPs mix、ゲルローディング色素、Taq DNA polymeraseなど、重要な成分がすべて含まれています。
理系の学生である私たちは、ストックからどのように作業溶液を調製するかに頭を悩ませています。
さて、
V1C1=V2C2を覚えていますか？
ここで、与えられた濃度C1は100mM（dNTPsのストック濃度）
V1は与えられた体積が未知（？)
C2は必要な濃度=2mM
V2は必要な体積=1000μL
ここでV1C1=V2C2
V1=V2C2/ C1
V1=1000×2/ 100
V1=20μL
ここで、。 作業液の調製に必要なdNTPはそれぞれ20μLなので、最終的には920μLのD/Wに80μLの（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）を混合することになります。
これにより、各dNTPの最終濃度は、1000μLのワーキングソリューションで2mMとなります。 200μMは自分で計算してください。
私のPCRにおけるdNTP使用法
必ずストック溶液を2本用意し、すべて-20℃に保存してください。
1週間に行う反応数を計算し、それに合わせてストックからワーキング溶液を調製し、4℃で保存してください。 凍結融解を繰り返すと、dNTPの活性が低下するため。
外来DNAの混入はPCR反応の妨げになりますので、作業溶液の調製時には必ずグローを装着し、無菌状態を維持してください。
dNTPの濃度は200μMで十分ですが、Long-range PCRでは2mMから3mMのdNTPを使用することができます。
dNTPの濃度が高くなると、非特異的結合の割合が増加する。 同様に、dNTPが不足するとPCR産物が不完全になる。 したがって、常に適切な量のdNTPsを使用する必要があります。
結論として、PCR反応におけるdNTPの働きはTaq DNAポリメラーゼと同様に重要である。
Taqの助けを借りて、dNTPは成長するDNA鎖と結合し、それを拡張します。 もし、このようなことに煩わされたくなければ、すぐに使えるPCRキットを使うのが望ましいでしょう。 ただし、試薬の調合は手作業になる
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