Nitrate Reduction Test

Neisseria and related species, three species – N. mucosa, M. catarrhalis, and K. denitrificans are reducing nitrate.は、ヒトのNeisseria属の中で、硝酸塩を還元する種である。 硝酸塩還元試験はN. gonorrhoeaeとK. denitrificansの鑑別に重要な試験で、特にK. denitrificansの株が染色塗抹でグラム陰性二重球菌と思われる場合である。

原則

細菌種は、硝酸塩を亜硝酸塩または窒素ガスに還元する能力で区別されることがある。 ヒト由来のNeisseriaceaeのうち、Neisseria mucosa、Moraxella catarrhalis、Kingella denitrificansの株は硝酸塩を還元する。 M. catarrhalisとK. denitrificansの株はN. gonorrhoeaeと誤同定されたことがある。 硝酸塩還元テストにより、硝酸塩陽性のこれらの種と硝酸塩陰性のN. gonorrhoeaeを区別することができる。 硝酸塩の還元は、種によっては嫌気性呼吸と連動している可能性がある

硝酸塩の還元に関わる生化学的経路を図1に示す。 硝酸塩は亜硝酸塩に還元され、その後、一酸化窒素、亜酸化窒素、または窒素に還元される可能性がある（図1）

Figure l. Nitrate reduction pathway.

硝酸還元試験は、生物との培養後の培地に亜硝酸塩を検出することに基づく。 培地中に存在する場合、亜硝酸はスルファニル酸（硝酸試薬A）と反応して無色の複合体（亜硝酸-スルファニル酸）を形成する。 この複合体は、図2に示すように、硝酸試薬B（α-ナフチルアミン）を添加すると、赤い沈殿物（プロントシル）を生成します。 培地中の亜硝酸塩の検出を図式化したもの。

培地中に亜硝酸塩が存在するときのみ、赤色が発生する。 スルファニル酸とα-ナフチルアミンを加えた後、培地に赤色が出ないのは、亜硝酸塩が培地に存在しないことを意味するだけである。

硝酸塩が亜硝酸塩に還元されて、一酸化窒素、亜酸化窒素、または亜硝酸塩と反応する試薬と反応しない窒素に完全に還元されている可能性があります。

硝酸塩試薬の添加後に陰性となる試験液は、2つの解釈のどちらが正しいか、さらに試験しなければならない。

硝酸塩還元試験の成功は、正しい条件の下で試験を行うことにかかっている。 しかし、いくつかのNeisseria種はブロス培地ではうまく成長しませんが、硝酸塩還元試験は、反応が起こるために十分な前駆体酵素を提供するために培地を大量に接種することによって成長をサポートしない培地でうまく行われるかもしれません

嫌気条件下でのみ、硝酸反応は起こります。 硝酸塩含有培地は、培地への酸素の拡散を制限する低い表面積：深さ比を与えるようにチューブに分注され、例えば、直径13mmのチューブに5mlの培地が分注される。 ナイセリアとその近縁種は培地中の酸素を利用し、硝酸塩の還元が起こるのに最適な嫌気状態を急速に作り出す。

硝酸塩還元試験は、0.2％の硝酸カリウムを含む培地で行われる。 この培地に被疑菌の純粋培養物を大量に接種し、35℃から36.5℃で48時間、炭酸ガスの補充ありまたはなしのインキュベーターで培養する。

硝酸塩還元はGriess Llosvay試薬、サルファニル酸およびα-ナフチルアミンで検出される。 スルファニル酸(硝酸試薬A)はインキュベーション混合物に加えられ、培地中に存在する亜硝酸塩と複合体(亜硝酸-スルファニル酸)を形成する。 α-ナフチルアミン（硝酸試薬B）をインキュベートした培地に添加すると、培地中に存在する亜硝酸-スルファニル酸複合体と赤色の沈殿物（プロントシル）が形成されます。

硝酸試薬AおよびBを培地に添加した後、培地中に赤色が発現した場合、その生物は硝酸塩を亜硝酸塩に還元したことを示し、硝酸塩陽性と報告することができる。 菌株は硝酸塩を亜硝酸塩に還元し、その後亜硝酸塩を完全に還元して窒素ガスにして、硝酸試薬AおよびBを培地に加えても検出されないことがあります。 スルファニル酸とα-ナフチルアミンを加えても培地の色が変わらない場合は、少量（ナイフポイント）の亜鉛ダストをインキュベートした培地に添加する。 亜鉛の粉は、化学的に硝酸塩を亜硝酸塩に還元する触媒となる。 従って、硝酸塩が生物によって還元されていない場合、すなわち硝酸塩陰性である場合、亜鉛の粉によって還元され、15分以内に培養液に赤色が発色することになる。 亜鉛の粉を加えた後、培養した培地に色がつかなければ、その生物は硝酸塩を亜硝酸塩に還元しただけでなく、亜硝酸塩を窒素ガスに還元したことになり、これらの生物は硝酸塩陽性である。

ガス発生を検出するために逆デュラム管で硝酸塩培地を供給するが、ナイセリア種ではガス発生は記録されない。 種によっては亜硝酸塩を越えて硝酸塩を還元して窒素ガスにする場合もあるが、ガスがチューブ内に蓄積しないこともある。 ガスの蓄積は、ガスが生成される速度に依存します。 ガスの発生が非常に遅い場合、ガスは培地に溶解し、ダーラム管に蓄積しないことがある。

検体の条件

最適な検体。 チョコレート寒天培地で、35℃～36.5℃、18～24時間培養したグラム陰性、オキシダーゼ陽性の疑わしいディプロコックス（ナイセリア属またはM. catarrhalis）の純粋培養物。

試験結果に影響を与える要因：

• 試験培地は、あらかじめ形成された酵素との反応が起こるように十分に多く植え付けなければならない。
• 培養管に加える亜鉛の粉が多すぎると、亜硝酸塩から窒素ガスへの硝酸塩の還元が非常に速くなり、亜硝酸塩が検出されない場合があります。
  • 検査は、24時間培養から採取した接種物のみで実施すること。
  • Nitrate mediumは培養器から取り出して30分以内に接種してください。室温での培養が長引くと酵素活性が低下することがあります。 Nitrate broth (Heart infusion broth containing 0.2% potassium nitrate)

    Heart infusion broth (Difco), 25.0 g
    Potassium nitrate, 2.0 g
    Distilled water, 1000.0 ml

    1. 成分を蒸留水にて溶解、pH7に調整する。0.1542>
    2. ブロスの5mlアリコートを、ガスインサート付き16mm×100mmチューブ（Durhamチューブ、6mm×50mm）に分注
    3. 121℃で15分間オートクレーブ

    使用するまで4℃〜10℃（冷蔵）で培地を保存する。 接種前に培地を室温に戻しておく。

    試薬 スルファニル酸溶液(硝酸試薬A): 0.8% in 5N acetic acid
    化学名: Sulfanilic acid (Nitrate Reagent A) 4-aminobenzene sulfonic acid
    硝酸試薬Aは、15℃〜30℃(室温)の暗所で3ヶ月間保存してください。 試薬は暗褐色のガラス容器に入れ、瓶はアルミホイルで包んで暗所に保管してもよい。

    α-ナフチルアミン溶液（硝酸試薬B）：5N酢酸中0.6％
    化学名。 N,N-dimethyl-1naphthylamine
    硝酸試薬Bは2℃〜8℃（冷蔵）、暗所で3ヶ月間保存してください。 試薬は暗褐色のガラス容器に入れ、瓶はアルミホイルで包んで暗所保存してもよい。

    亜鉛粉末、試薬グレード：室温（15℃～30℃）で保存

    注意事項: 酢酸は腐食性があります。 皮膚に触れると水ぶくれや火傷を起こすことがあります。 接触した場合は、直ちに多量の水で目や皮膚を洗い流してください（少なくとも15分間）

    品質管理/試験方法

    QC strain:

    • 硝酸還元酵素陽性のコントロール。 Kingella denitrificans、CDC 10,236
    • 硝酸還元酵素陰性コントロール。 Neisseria gonorrhoeae, ATCC 43069

    QC株は20%グリセロールを含むTryptic soy brothの溶液で-70℃で保存する。 対照株は、凍結保存時に反応を確認する。 QC株は-70℃で2年間保存可能である。

    操作方法：

    QC株は臨床分離株と同様の方法で検査される。 QC株は、凍結検体からの初回培養後、少なくとも1回は再培養してから検査に臨む。 臨床分離株は、選択培地から継代培養する場合と、精製した継代培養を行う場合があります。 2345>

    1. -70℃で保存していたコントロール株バイアルを解凍する。
    2. チョコレート寒天培地またはGC培地添加プレートに株分けを行う。 35℃〜36.5℃、18〜24時間培養する。

    3. 滅菌綿棒を用い、チョコレート培地で培養した分離株の純粋培養から分離したコロニーの重い懸濁液を35℃〜36.5℃で調製し、その懸濁液から分離したコロニーを分離する。5℃、18～24時間、炭酸ガス濃縮雰囲気下で培養し、試験培地に接種する。

    4. 接種した培地と接種していない対照培地のチューブを35℃から36.5℃、二酸化炭素濃縮雰囲気下で48時間インキュベートする。

    5. 48時間培養後、それぞれのチューブに試薬#Aを5滴、次に試薬#Bを5滴パスツールピペットで滴下する。 チューブをよく振って試薬と培地を混ぜ合わせる。

       懸濁液のピンク・レッドの色を調べる。 試薬を加えたときに培地が冷たいと、反応に少し時間がかかることがあります。

       亜鉛粉末を加える前に懸濁液がピンク色になれば、反応は陽性で検査は完了です。 手順4は行わないでください。

       接種していない培地対照、硝酸塩陰性、硝酸塩陽性の分離株で観察された反応をそれぞれ図3、図4、図5に示します。

    6. 試薬AおよびBを添加しても懸濁液が無色の場合、少量（4〜5mg、「鋭いナイフの先」）の亜鉛粉末を培地に添加してください。 チューブを激しく振り、室温で10～15分放置します。

       亜鉛粉末を加えた後も培地が無色であれば陽性、
       亜鉛粉末を加えた後に培地がピンク色になれば陰性です。

    7. 結果を読み取り記録します。

    図3． 植菌していない硝酸塩培地で観察される反応
    

    図4.硝酸塩培地で観察される反応。 硝酸塩陰性種で観察される反応
    

    図5.硝酸塩陰性種で観察される反応。
    

    品質管理スケジュール：

    • 硝酸還元酵素QCテストは、臨床分離株を検査する日に実施します。

    問題 & 解決策

    硝酸還元テストは培地を正確に作成しない場合やテストを正確に行わない場合に偽陰性または偽陽性を示すことがあります。 この試験の反応は多くの要因に左右されます。

    • 亜鉛ダストを添加した後、植菌していない培地対照管にピンク色が検出されないのは、（1）培地に硝酸塩が含まれていない、（2）亜鉛ダストの添加量が多すぎて、亜硝酸塩を超えて窒素ガスへの還元が触媒されたためと思われます。 最も簡単な解決策は、ベースとなる培地に硝酸塩が添加されていることを確認し、硝酸塩培地をさらに入手することである。 あるいは、陽性対照株を培地に接種し、より短い培養時間で反応を調べる。N. mucosaの株は、数時間の培養で陽性の亜硝酸塩反応を生じる。 培地に硝酸塩が含まれていることが確認された場合、添加すべき亜鉛ダストの適切な量が決定するまで試験を繰り返す。 検査に加える亜鉛粉の量を知ることは非常に重要である。 1542>
    • 硝酸塩試薬AおよびBを培地に添加した後、植菌していない培地コントロールにピンク色が検出された場合、培地は亜硝酸塩で汚染されています。
    • 硝酸塩を含む培地において、陽性対照株であるKingella denitrificansが陽性反応を示さないのは、その株がK. denitrificansでない場合のみである。 陽性対照株の同一性を再確認する。 その対照菌株の新しい培養物を選んで、試験を繰り返す。 同様に、陰性対照株であるN. gonorrhoeaeで硝酸還元酵素試験が陽性の場合、陰性対照株がN. gonorrhoeaeでないか、培養物が硝酸塩陽性の生物に汚染されているかのどちらかである。 淋菌参照株の純度および同一性を再確認する。 1542>
    • 硝酸塩還元反応は、嫌気性条件下でのみ起こる反応である硝酸塩を還元する生物の能力を示し、生物が酸素の供給を受け続ける場合には、この反応は起こりません。 従って、培地が浅く分布し、酸素が培地中に拡散するような静置培養（特に生育の遅い種）では、反応が起きないことがある。 培地中に酸素が存在するかどうかを調べるには、オキシダーゼ試薬を培地に一滴垂らしてみる。 培地が紫色になった場合は、培地に酸素が含まれており、硝酸塩の還元反応が起きていない可能性があります。 培地が無色のままであれば、培地に酸素が含まれておらず、硝酸塩還元反応が起きている可能性があります。 N. gonorrhoeaeの細胞は、培地に十分な細胞を接種した場合、急速に酸素を消費することが指摘されている。 1〜2時間程度培養した後、オキシダーゼ試薬を添加すると、培地は透明に保たれる。 オキシダーゼ試薬が培地中の淋菌を死滅させるため、酸素が培地中に拡散すると、培地はチューブの上部から徐々に紫色に変化します。 培地を上記と異なる寸法のチューブに分注する場合、表面積と深さの比が少なくとも上記と同等かそれ以下であることを確認する。 1542>

    • 硝酸塩還元反応は、試験を行う培地が生物の正常な生育を認めない場合、起こらないことがある。 しかし、あらかじめ形成された酵素が既存の酸素供給を使い果たし、酸素が培地中に拡散する速度よりも速い速度で硝酸塩を還元できるよう、接種物が十分に密であれば、生物の成長をサポートしない培地で試験を行うことができる。

      注：培地から酸素が除去されていることを確認するには、酸化酵素試薬2～3滴を接種した培地の複製に加える。 培地中の酸素が十分に除去されていれば、Oxidase試薬はすぐには紫色に変化しません。 培地中に溶存酸素がある場合は、オキシダーゼ試薬は紫色に変化します。 なお、硝酸塩還元試験は、オキシダーゼ試薬を添加した培地で行ってもよい。

    • 試薬Aを試験培地に添加すると、硝酸塩の還元により生じた亜硝酸塩が、試薬B中のα-ナフチルアミンと赤い沈殿を生じるスルファニル酸に錯体を形成する。 ただし、試薬A、Bを添加しても赤色が出ない場合は、必ずしも硝酸塩が還元されなかったことを意味するものではありません。 赤色に発色しないのは、（1）硝酸塩が還元されなかった場合、（2）硝酸塩の還元により生成した亜硝酸塩がそれ自体窒素ガスに還元された場合、が考えられます。 亜硝酸塩が還元されたかどうかは、試薬AとBを加えて無色になった培養液に少量の亜鉛の粉を入れると、亜鉛の粉が触媒となって硝酸塩が還元され、まだ還元されていない硝酸塩を含む培地に赤色が現れるはずである。 しかし、亜鉛の粉を加えすぎないことが重要です。過剰な亜鉛の粉は、その硝酸塩から生成した亜硝酸塩の還元を触媒し、結果として無色の培地となり、検査を陽性と間違って解釈してしまいます（偽陽性結果）
    • 亜鉛の粉を加えた後に、陰性対照株N. gonorrhoeaeで硝酸還元酵素試験が陽性となることは、おそらく検査に亜鉛の粉が多く加えられたため硝酸塩を越えて減少したことを表します。 亜鉛華の添加量が少ないことを確認し、再度試験を行う。 ピンク色は、生物が硝酸塩を還元していないことを示し、発色するのに10～15分かかることがあります。 亜鉛の粉を追加しないでください。 発色するのを待つ。

    検査の限界

    検査が適切に行われ、品質管理株が適切な結果を出せば、この検査に限界はないはずです。

    硝酸塩還元試験のみでは属や種の同定はできない。

    結果、解釈、報告

    試薬AおよびB添加後の接種培地から亜硝酸（ピンク色）が検出されるか、亜鉛末添加後の培地に色がなければNitrate-positiveとして分離株を報告してもよい。

    試薬A、B添加後に亜硝酸塩が検出されない（色の変化がない）場合、あるいは接種した培地に亜鉛粉を添加した後にピンク色が発現する場合、分離株はNitrate-negativeと報告してもよい

    文献

    Knapp JS, Clark VL.Nitrate-negative (邦題：硝酸塩陰性の分離株). 亜硝酸塩還元と連動した淋菌の嫌気性増殖。 Infect Immun 1984;46:176-181.

    Skerman VBD. 1967. p.218 – 220. 細菌の属の同定へのガイド。 ウィリアムズ&ウィルキンス社、ボルチモア、メリーランド州