Mitochondrial biogenesis and metabolic hyperactivation limits of application of MTT assay in the estimation of radiation induced growth in the MTT assay

放射線による代謝的生存率の変化は成長阻害と相関しない

MTTアッセイと細胞数カウントを用いて様々な細胞株で放射線による成長阻害を研究している。 その結果、代謝生存率に基づくアッセイで得られた結果は、放射線被曝後の異なる時点における実際の細胞数とは相関しないことがわかった。 MTTアッセイは、任意のサンプル中の生存細胞数を真に表すという事実に基づいて広く使用されているため2,3,4。 我々は、MTT値と細胞数を比較することにより、このアッセイを検討した。 指数関数的に増殖する細胞に電離放射線を照射し、細胞数およびテトルゾリウム塩のホルマザンへの還元をそれぞれ計数することにより、増殖阻害および代謝生存率を解析した（古典的MTTアッセイ；ここではMTT指数として使用する）。 主に、細胞に異なる線量の電離放射線（2、3、5、7Gy）を照射し、放射線量に依存する変化と細胞数および代謝生存率の相関を観察した。 3種類の細胞株（A549、MDA-MB-231、HeLa）の照射後48時間のホルマザン生成量（すなわちMTT指数）は、未照射細胞に比べ20～35％減少（5Gy、7Gy時；補足図1Ai～Ci）、細胞数の減少率は70～90％（補足図1B）であることがわかった。 1Aii～Cii）。このことは、すべての放射線量において、代謝生存率（MTT指数）と増殖抑制率（細胞数）の相関がないことを明確に示している。

さらに、この観察の一般性を調べるために、7つの非腫瘍性細胞株および腫瘍性細胞株（NIH/3T3、Raw 264.7、HEK-293、HeLa、A549、MCF-7、MDA-MB-231）に対して、単一線量（5 Gy）で細胞数の変化（増殖抑制）とMTT指数（代謝的生存率）の関係を調べたところ、試験した3細胞でほぼ50％の増殖抑制が見られた（補足図1）。 照射後24時間では、比較的放射線感受性の高いRaw 264.7 (Fig. 1Bi)を除き、評価したすべての細胞株がコントロールと同等か、MTT指数の値の上昇を示した（図1Ai〜Gi）。 一方、この条件下では、細胞数の著しい減少が認められた（Fig. 1Aii〜Gii）。 照射後48時間では、細胞数は対照と比較して43％（MDA-MB-231、図1Gii）から76％（Raw 264.7、図1Bii）と著しく減少したが、MTT指数値はそれぞれ10％から37％しか減少せず、Raw264.7細胞株が最大となった（図1Bi）。 MTTインデックス（ΔOD）の値を対応する細胞数で正規化すると、24時間および48時間で細胞あたりの代謝生存率（由来情報）が1.4～3倍（細胞株によって異なる）向上し、Raw264.7、NIH/3T3およびHeLa細胞を除くほとんどの細胞株で48時間でさらに減少したが、それぞれのコントロールより有意に高いままだった（図1AiiiからGiii）。 これらの観察から、放射線による増殖抑制や細胞毒性の真の指標である細胞数は、放射線反応の迅速な評価に広く用いられている代謝的生存率に基づく（MTT）アッセイとは相関がないことが明確に示され、これは放射線による代謝的生存率の上昇に起因すると思われる（Fig. 5768>

放射線被曝はミトコンドリア質量の増加により代謝的生存率を増強する

MTTからホルマザンへの変換は主にミトコンドリアで起こるため、放射線被曝細胞の代謝的生存率の増加は、ミトコンドリアの過活動またはミトコンドリアの質量増加によるものと思われる7、8、9、10。 電離放射線は、被ばくした細胞のミトコンドリア量と機能を誘導することが知られている20,21。 そこで、放射線被曝細胞におけるミトコンドリア質量の増加がMTT指数の上昇に関与しているかどうかをフローサイトメトリーにより検討した。 その結果、被曝後24時間および48時間において、細胞当たりの平均ミトコンドリア量が、MCF-7（最小、図2Fi）からRaw 264.7 （最大、図2Bi）において4倍近く有意に増加した（図2AiからGi）。 同時に、照射した細胞では、細胞あたりのホルマザン産生の増加がそれぞれの時点で観察され、同様の実験条件下で定量した（図2AiiからGii）。 照射後24時間の顕微鏡写真でも、照射細胞では対照細胞に比べて目に見えてフォルマザンの沈着が促進されている（図2Aiii～Giii）。 対照細胞のホルマザン含有体（ミトコンドリア）は色が薄く、細胞質内にまばらに均一に分布しているが、被曝細胞では色が濃く、核周辺に集まっている（図2Aiii～Giii）。 これらの顕微鏡写真は、放射線照射した細胞ではMTT指数が高いこと、あるいは細胞あたりの代謝生存率が向上していることを視覚的に裏付ける証拠となる。 さらに、照射された生存細胞の数が減少すると、未処理の対照細胞よりも細胞あたりはるかに多量のホルマザン（色濃度）が生成され、データの誤った解釈を招くことを立証している。 ミトコンドリア質量は、指定された時点でミトトラッカーグリーンFM（100 nM、20分）で細胞を染色することにより分析した。 平均蛍光強度（MFI）を示すグラフA〜Gi（図1に記載の細胞株）、コントロールに対する倍率変化として示した。 (Aiii-Gii）細胞当たり形成されたフォルマザンを分光光度法で定量し、異なる細胞株におけるそれぞれの時点におけるコントロールの倍数変化として示した。 (Aiii-Giii）異なる細胞株において、照射後24時間で2時間のMTTインキュベーション後に撮影した、対照および照射細胞におけるホルマザン蓄積を示す写真（20倍の対物レンズで）。 照射細胞1個のズーム画像は、強調されたパンクチュエーション・フォルマザン沈着を示すためにハイライトされている。

放射線はミトコンドリア生合成を誘導することによって代謝的生存率を高める

ミトコンドリアはMTTがホルマザンに還元される主要な場所であり7、8、9、10、したがってミトコンドリア量が増加することによって代謝的生存率を高めることができる。 照射細胞におけるミトコンドリア量の増加は、2つの理由によるものと考えられる。まず、電離放射線はG2/Mブロックを誘導し22,23 G2期に停止した細胞はミトコンドリアの数が多くなり22,23,24照射した細胞ではより多くのMTTをホルマザンに還元できるようになった。 第二に、電離放射線はミトコンドリア生合成を誘導することが知られており20,21、その結果、ミトコンドリアの質量が増加する。 そこで、照射細胞の細胞あたりのミトコンドリア量が増加する原因が、放射線による G2/M 停止なのかミトコンドリア新生なのか、あるいはその両方なのかについて、両仮説を順次検証してみた。 放射線によるミトコンドリア量の増加（図2AiからGi）はすべての細胞株で観察されたので、放射線による代謝的生存率の増加のメカニズムを理解するためにHeLaとMDA-MB-231細胞のみを無作為に選択した

放射線後24時間および48時間の細胞周期分布を行った。 24時間後、HeLa細胞およびMDA-MB-231細胞において、細胞周期のG2/M分画にそれぞれ17および6％の過剰細胞集団が認められた。 しかし、このブロックは48時間後には完全に解除された（図3A）。このことは、放射線による細胞周期停止が、24時間後のミトコンドリア量の増加には一部寄与しているが、48時間後には寄与していない可能性があることを示唆している。 また、G2/M 期にある細胞数が 17％近く増加しても、HeLa 細胞では 24 時間後のミトコンドリア量に 1.9 倍（これは 90％高い）の変化を、MTT のホルマザンへの還元に 1.5 倍の変化をもたらすことはできない（図 2Di および Dii）。 48時間後には細胞周期ブロックは完全に解除されたが、ミトコンドリア量と代謝生存率の増加は、それぞれのコントロールより有意に高いままであった。 これらの観察結果は、ポリフェノール化合物処理で先に報告されたように、放射線による代謝生存率の向上が細胞周期停止を介したミトコンドリア量の増加のためであるという命題を支持しない18,25。

さらに、被曝細胞におけるミトコンドリア量の増加と相関する放射線誘発高代謝活性（図2AiからGi）が、放射線誘発ミトコンドリア生合成によるという仮説を調べるために、対照細胞と被曝細胞のmtDNAコピー数分析を実施した。 Leu t-RNA遺伝子のコピー数は、ミトコンドリアゲノムがコードするmtDNAのコピー数を測定し、核pol-γで正規化したものを、半定量PCR法で測定した。 HeLa細胞およびMDA-MB-231細胞はともに、放射線照射24時間後に18％と31％のmtDNAコピー数の増加を示し、48時間後には対照細胞よりもHeLaで138％、MDA-MB-231で21％増加したままである（図3B）。 さらに、ウェスタンブロットを用いて、PGC-1α（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α）およびTFAM（Mitochondrial Transcription Factor A）タンパク質の発現レベルの時間依存性を調べたところ、PGC-1αおよびTFAMは、放射線照射後24時間経過しても、対照細胞に比べて138％まで増加した。 この2つのタンパク質は、細胞内のミトコンドリア生合成と維持の重要なレギュレーターである26,27,28。 興味深いことに、放射線に曝露した細胞（HeLaおよびMDA-MB-231）では、PGC-1αおよびTFAMの発現が時間依存的に増加し（図3C）、これは24時間後のミトコンドリア量の増加と相関している（図2DiおよびGi）。 さらに、増強されたミトコンドリアが機能的で、MTTをホルマザンに変換する主要な還元酵素であるSDH-Aタンパク質の発現を増強しているかどうかを確認した7,8,9,10。 このことは、HeLa細胞やMDA-MB-231細胞のMTT指数の上昇や代謝的生存率の上昇と関連している（図1および図2）。 SDH-Aレベルは、他の細胞株でも有意に増加していることがわかった（データは示していない）。 さらに、放射線によるミトコンドリア新生の結果、代謝活性が上昇するという仮説を検証するために、クロラムフェニコールを使ってミトコンドリア新生を阻害した29,30。 放射線照射前にクロラムフェニコールで処理した細胞で MTT および成長速度論（図 3E および F）を行ったところ、放射線単独よりも有意に低いホルマザン生成を示し（図 3E）、放射線による代謝生存率の向上が主にミトコンドリア新生に起因することが示唆された。 また、クロラムフェニコール処理した細胞では、MTTアッセイで得られた放射線誘発成長阻害曲線と細胞計数の差がわずか8％に留まった（図3EおよびF）。一方、HeLaおよびMDA-MB-231細胞ではそれぞれ25％と33％だった（図1Dii-iiおよびGi-ii）。 これらの結果は、放射線によるミトコンドリア量の増加および代謝的生存率の向上は、放射線によるミトコンドリア生合成に由来し、この生合成は放射線によるPGC-1αおよびTFAMによって制御されているという仮説を立証するものである。

放射線によるミトコンドリアの過活性化

先の結果では、電離放射線が細胞内のミトコンドリア量を誘導し、それが照射細胞の代謝活性（MTT index）上昇に関与していると思われたが、放射線は照射細胞内の個々のミトコンドリアの過活性化も誘導することが知られている31。 MTT index の上昇がミトコンドリア量の増加のみによるものか、あるいは放射線によるミトコンドリアの過活性化によ るものかを判断するために、TMRM を用いて蛍光顕微鏡でΔΨm（ミトコンドリア膜電位、MMP）を測定し た。 照射細胞（24 時間後）は、対照と比較して、ΔΨm が高いことを示唆する鮮やかな赤色の点状ミトコンドリアを示した（図 4A）。 この結果は、さらにフローサイトメトリーによるDiOC6を用いたΔΨm の定量的推定によって検証された。 HeLa細胞ではMMPが2.4倍から2.8倍に増加したが、MDA-MB-231細胞では両時点で放射線誘発MMPがそれぞれ1.3倍に変化した（図4B）。 この高いミトコンドリア膜電位は、照射細胞の各ミトコンドリアにおける数倍の高いホルマザン形成と相関しており（図2Aiiiの挿入写真）、おそらく放射線誘発ΔΨmの増加による複合体II（SDH）活性の上昇（図2AiiからGii）を示唆している。 この観察は、ストレス条件下では複合体IIがより効率的にΔΨmを確立し維持することを示唆する、他の研究での以前の知見と一致している32,33。 複合体IIの過活性によるΔΨmの増加は、他のミトコンドリア脱水素酵素の活性を確実に高め、SDH以外のホルマザン形成の増加にも寄与している可能性がある。 (A）照射後24時間のTMRM（5 nM/ml；30分；37℃）で染色したHeLa細胞およびMDA-MB-231細胞のミトコンドリア膜電位（MMP）を示す顕微鏡写真である。 放射線によるミトコンドリアMMPの変化をDiOC6で定量し（B）、スーパーオキシドラジカルをMitoSoxで定量し（C）、コントロールに対する指示時点のMFI fold changeとして示した。 星印は、指示されたグループ間の変化の統計的有意性を示す。 データは3連の平均値±SDで表した。 *このような状況において、ミトコンドリアの活性酸素の生成は、複合体II（SDH）を介したコハク酸による酸化が大きく寄与していることが明らかになった34． そこで、高代謝活性のミトコンドリアがより多くのスーパーオキシドラジカルを生成するはずだという事実を検証するために、コントロールと照射細胞のミトコンドリアスーパーオキシドレベルを分析した。 MitoSox（ミトコンドリア ROS インジケーター）で染色した細胞をフローサイトメーターで解析した。 照射された細胞は、MitoSox の蛍光が対照細胞よりも有意に増強された。 両細胞とも 24 時間後にミトコンドリア ROS が 1.25 倍近く増加したが、照射後 48 時間で HeLa で 1.65 倍、MDA-MB-231 で 1.5 倍にさらに増加した（図 4C）。 ミトコンドリアの脱水素酵素である SDH は MTT の還元に主に寄与している7,8,9,10 ので、これらの結果は、活性酸素の増加が SDH 活性の増強に正比例するという観察を検証している34。 これらの結果から、ミトコンドリア量の増加は、機能的に亢進したミトコンドリアからなり、照射した試料では細胞あたりより多くのMTTをホルマザンで還元していることが示唆された。

放射線によるミトコンドリアへのカルシウム蓄積

電離放射線は細胞のカルシウムの恒常性を乱し、小胞体から細胞質へのカルシウムの放出を促進し、細胞の核周辺にある機能的ミトコンドリアによってそのカルシウムがバッファされる35,36。 カルシウムのホメオスタシスの変化はまた、ROS（活性酸素種）産生およびミトコンドリア生合成を誘導する35,36,37。

24時間および48時間に観察された代謝生存率の増加が、細胞質およびミトコンドリアのCa2+レベルの増強によるものかどうかを調べるために、自由細胞およびミトコンドリアのCa2+が見積もられた。 対照細胞および処理細胞をそれぞれの時点でFluo-3AM（Ca2+指標）およびRhod-2AM（特異的ミトコンドリアCa2+指標）38で染色し、フローサイトメーターで解析した。 照射細胞ではカルシウムの有意な増加が観察され、調査した両方の細胞株（HeLaとMDA-MB-231）で約1.4倍（40％）増加した。これは、8時間後のFluo-3蛍光の増加が示唆しており、24時間後には僅かに減少する（図5A）。 興味深いことに、放射線照射によってミトコンドリアCa2+がさらに増加した（HeLaで2.4倍、MDA-MB-231で1.6倍、図5B）。 この観察は、染色した細胞を蛍光顕微鏡で可視化することでさらに検証された。 放射線処理後 24 時間に、Mitotracker Red、Fluo-3AM、Rhod-2AM でそれぞれ染色した細胞を観察した。 Fluo-3AM、Rhod-2AM ともに、被曝細胞ではミトトラッカーレッドと同じパターンで核周辺に強い点状蛍光を示し（図 5C）、細胞質 Ca2+ がミトコンドリアに蓄積していることが示唆された。 さらに、Rhod-2AM染色した細胞では、ミトコンドリアからの特異的なCa2+シグナルが観測され、この観察が検証された。 興味深いことに、MDA-MB-231 細胞は、対照細胞で既に高いミトコンドリア Ca2+ （Rhod-2-AM 染色）と核周囲のミトコンドリアクラスター化（Mitotracker Red 染色）を示し、照射後さらに増加した。これは、この細胞が放射線誘発ミトコンドリア生合成とフォルマザン生成の増加を、その後最も少なくした理由かもしれ ない。 放射線はミトコンドリア内に Ca2+ を蓄積させ、ミトコンドリア損傷とマイトファジーを引き起こすことを、 我々は以前の研究で明らかにしている36 。 Ca2+ が高くミトコンドリア膜電位が上昇したミトコンドリアは A23187 をより多く蓄積し、UV 励起により 顕微鏡下で明るい蛍光を示すようになる。 しかし、永久損傷したミトコンドリアは非常に高い蛍光を示し、細胞内の丸いボディのように見える36。 このような実験条件下でミトコンドリアへの Ca2+ の蓄積を観察するために、対照細胞および照射した HeLa と MDA-MB-231 細胞を照射後 24 時間で染色した（Fig. 5C）。 照射細胞では、放射線によって損傷を受けたミトコンドリアを示す小体の蓄積も多く見られた。 照射細胞は、ミトコンドリアが小胞体とネットワークを形成し、小胞体から漏出したストレスに よる Ca2+ を蓄積し、細胞を死から守っている核周辺領域で Mitotracker Red, Fluo-3AM, Rhod-2AM の蛍光が高 くなった（図 5C）39。 このことは、放射線被曝後に蓄積されたCa2+が、主にミトコンドリアに蓄積されることを示唆している。 ミトコンドリアマトリックスに高いCa2+が存在するとSDH活性が増強されることが先に報告されている40。 したがって、ミトコンドリア内に蓄積したCa2+がSDH複合体活性を上昇させ、ミトコンドリアが高活性化し、放射線被曝細胞の代謝生存率が上昇することを相関させた。

Calcium accumulation in mitochondria leads to cellular hyperactive metabolic state

Formazan formation enhanced における Ca2+ の役割を実証するために、細胞内の Ca2+ の乱れが代謝の実行性を高めるかどうかをテストしてみた。 この命題を検証するために、細胞をCa2+イオノフォアA23187（2μM、電離放射線と同じように細胞質Ca2+を増加させる）で1時間処理し、処理後4、8、24時間後の代謝生存率を分析した。 興味深いことに、A23187で処理した細胞は、処理後8時間&24時間、MDA-MB-231では4時間&8時間で、細胞あたりの代謝生存率が有意に増加（1.6倍）した（図6A）。 これらの結果は、細胞質Ca2+の増強が、ミトコンドリアへのCa2+の蓄積を増加させることにより、代謝生存率を増加させることを示唆している（図5C）。 また、ミトコンドリアへのCa2+の蓄積を抑制することで、放射線によるミトコンドリア質量の増加が抑制されるかどうかを確認した。 興味深いことに、ミトコンドリアのCa2+ユニポーターの阻害剤であるルテニウムレッド（RuR、ミトコンドリアへのCa2+の蓄積を阻害する）で処理した細胞は、放射線単独と比較してミトコンドリア量の増加（放射線誘発）が著しく低いことがわかった（図6B）。 Ca2+ の増加は CaMKII (Calmodulin Kinase-II) 37,41 を介してミトコンドリア生合成を誘導することが知られており、この CaMKII は PGC-1α の発現を調節することが知られているミトコンドリア常在タンクでもある37, 41,42. したがって、ルテニウムレッドを用いてミトコンドリアへの Ca2+ の蓄積を抑制すると、おそらくミトコンドリア生合成を抑制することにより、ミトコンドリア量が減少したと結論づけられる。 さらに、放射線照射によって増加した細胞質 Ca2+ とミトコンドリアへの蓄積が、照射細胞の代謝生存率を高めるかどうかを検証するために、照射の 30 分前に BAPTA-AM（細胞内カルシウムキレート剤）と RuR で細胞を処理した。 BAPTA-AMを用いた細胞質内Ca2+のキレート作用（図6C）とRuRを用いたミトコンドリアへのCa2+蓄積の抑制（図6D）は、いずれも24時間および48時間後のHeLa細胞およびMDA-MB-231細胞の放射線誘発代謝生存率の増加を無効にした（図6CおよびD）。 これらの結果は、放射線によるCa2+ホメオスタシスの乱れが、おそらくミトコンドリア生合成の上流で、ミトコンドリアの過活性化および代謝生存率の向上に重要な役割を果たすことを示唆している。 (A）細胞をA23187（2μM；1時間）で処理し、ER蓄積Ca2+を4、8、24時間放出させ、HeLaとMDA-MB-231細胞でMTTアッセイによりMTT指数を測定した。 結果は、代謝生存率／細胞の倍数変化として示し、コントロールに関して正規化した。 (B）ミトコンドリア含有量は、ルテニウムレッド（1μM、連続暴露）処理細胞においてミトトラッカーグリーンを用いてフローサイトメーターにより分析し、コントロールに関する相対的な倍数変化として提示した。 (C と D) HeLa と MDA-MB-231 細胞を Ca2+ キレート剤 BAPTA-AM (20 µM, 2 時間) とルテニウムレッドで処理してから照射し、さらに代謝生存率を測定して、コントロールに対する変化率として表示した。 データは4つの独立した実験からの平均±SDとして提示されている *p < 0.05 vs. control.