図2(a)はDAPI-FITCフィルターブロックを用いた蛍光発光プロファイルで、細胞内の糸状アクチンネットワークに結合するファロイジンを結合させたアレクサフルオロ488で染色したインド・ムンジャック鹿毛線維芽細胞の培養液を使用しています。 Alexa Fluor 488の可視光吸収極大は495ナノメートル、発光極大は519ナノメートルの緑色領域で発生する。 さらに、DAPI(細胞核のDNAを標的にする;励起波長358ナノメートル、発光波長461ナノメートル)およびMitoTracker Red CMXRos(ミトコンドリアを標的にする;赤色発光)で同時に染色した。 赤色の蛍光体(MitoTracker)からのシグナルはないが、アクチンフィラメントによって示される明るい緑色の蛍光の存在と、細胞核のDAPIからのわずかに低い強度の青色のシグナルに注意。
ゴブレット細胞の粘液に特異的である青色の蛍光レクチン、Alexa Fluor 350 wheat germ agglutininで染色したマウス腸の薄切片は、図2(b)に提示されている。 さらに、Alexa Fluor 568ファロイジン(糸状アクチン;600ナノメートル発光)とSYTOX Green(核;504ナノメートル励起、523ナノメートル発光)で標本は同時に染色された。 青色の蛍光体(Alexa Fluor 350)の信号レベルは低いですが、SYTOX Greenの蛍光により組織標本中の核が明るい緑色の蛍光を発していることに注意してください。
図2(c)は、一次抗ウシα-チューブリンマウスモノクローナル抗体で免疫蛍光標識した後、Alexa Fluor 488に結合したヤギ抗マウスFab断片を加えたラットカンガルー(PtK2)上皮細胞の培養からの蛍光発光強度を示しています。 さらに、細胞核のDNAに選択的に結合するHoechst 33258とミトトラッカーレッドCMXRos(ミトコンドリアを標的とする;赤色蛍光)で標識した試料を用いた。 細胞質全体に広がる細胞内微小管網の緑色の染色と、核内のDNAに結合したHoechst 33258の青色の発光が目立つことに注目。
一次抗シトクロム酸化酵素マウスモノクローナル抗体で免疫蛍光標識したスイスマウス(3T3株)細胞と、Alexa Fluor 568と結合したヤギ抗マウスFab断片を図2(d)に示す。 この標本は、Alexa Fluor 488(緑色発光)に結合したレクチンHelix pomatia agglutinin(HPA)を含むいくつかの追加プローブでも標識された。 細胞骨格のアクチンフィラメントはAlexa Fluor 680(赤色励起;近赤外発光)で染色し、核DNAはDAPI(青色発光)で標識した。 ゴルジ体の顕著な緑色の染色と核で観察される青色の蛍光強度に注意。
複数の(3)蛍光色素で染色したマウス腎臓の薄切片からの蛍光発光を図2(e)に示す。 組織切片の核は、細胞培養や組織切片のDNAと結合したときに358ナノメートルに励起極大、461ナノメートルに発光極大を持つ核酸プローブDAPIで標的にした。 さらに、Alexa Fluor 488 wheat germ agglutinin (glomeruli and convoluted tubules) とAlexa Fluor 568 phalloidin (filamentous actin and the brush border)で同時に染色した。 青色(DAPI)と緑色(Alexa Fluor 488)の両方のプローブからの信号が存在するが、アクチンとブラシボーダーのネットワークではAlexa Fluor 568結合体によるオレンジ-赤色蛍光がないことに注意されたい。 植物組織における内因性の自家蛍光は、クロロフィル、カロチン、キサントフィルなどの様々な生体分子によって生じる。 クロロフィルは、紫外線や青色の励起領域において、高い消光係数を持つ吸収帯を持ち、350~500ナノメートルの波長で励起すると、かなりの量の蛍光を発生させる。 上図のコーンカーネル組織では、青と緑のスペクトル領域に自家蛍光の発光強度があることに注目してください。これは、ニコンのDAPI-FITC蛍光フィルターの組み合わせに特徴的です。
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