Immunohistochemistry

Immunohistochemistry (IHC) は、組織サンプル中の細胞成分、たとえばタンパク質やその他の高分子を可視化するための、顕微鏡を用いた強力な技術です。 IHCの強みは、異なる細胞タイプ、生物学的状態、および/または複雑な組織内の細胞内局在のコンテキストにおける標的タンパク質の存在および局在を明らかにする直感的な視覚的出力である

IHC技術は1940年代に発明され（Coons、Creech、& Jones、1941）、例えば診断目的または最適化治療レジームの患者の層別化に医療および病理学における重要ツールとして日常的に使用されています。 IHCはまた、健康な細胞や組織、病気の細胞や組織における役割を分子、細胞、組織レベルで研究するために、関心のある分子を分析する研究においても広く利用されています。 IHCまたはIHCに基づく方法を用いて組織中の標的の可視化を行うには多くの異なる方法があり、異なるアプリケーションやアッセイに対して多数のプロトコルが存在しています。 IHC法は一般に堅牢で確立された方法であるが、新しいアッセイは組織や標的タンパク質、結合分子、レポーターシステムの特性によって、しばしば慎重な最適化が必要となる。 長年にわたる技術開発と特異的結合分子の入手可能性の飛躍的な向上により、IHCの有用性と応用領域は大幅に拡大された。 IHCの技術や試薬の進歩により、科学者や医療従事者は、より正確なツール、アッセイ、バイオマーカーを利用することができるようになりました。 4037>

古典的なIHC法は図1に示されており、組織サンプル内の単一のタンパク質-ターゲットによって発現されたエピトープを、それらのエピトープと高い特異性で結合できる「一次抗体」を用いて検出するものです。 エピトープと抗体が結合した後、一次抗体と高い特異性を持って結合することができる「二次抗体」が加えられる。 二次抗体はレポーター分子に結合しており、抗体-抗体結合イベントの後、レポーター分子と反応する化学基質が加えられ、エピトープ-抗体複合体全体の部位に着色した沈殿が生成される。

Figure 1. 免疫組織化学の基本原理

模式図（図1）では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を、特定のタンパク質標的に向けた一次抗体で染色している。 一次抗体を含む溶液を組織切片に加え、抗体が標的を見つけ結合するのにしばらく時間を置く。 この後、結合しなかった抗体や余剰の抗体を洗浄し、二次抗体を添加する。 二次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）酵素を持つリンカー分子を持ち、一次抗体と結合するまでに時間がかかり、その後、再び洗浄のステップが行われる。 この後、3,3′ ジアミノベンジジン (DAB) が添加されます。 HRP酵素はDAB基質を茶色い沈殿に変え、反応した場所の組織に沈着させるので、一次抗体が最初にターゲットと結合した場所を視覚的に表現することができます。 IHCのための最も一般的な処理は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織ブロックを調製することである。 ホルマリン固定の目的は、組織内のタンパク質を化学的に架橋させることである。 これにより、すべての細胞プロセスが停止され、細胞成分が固定時の場所とコンフォメーションで凍結され、劣化も防止されます。 十分な固定後、組織はさらに処理され、最終的にはパラフィンブロックに包埋され、ミクロトームを用いて薄切片（通常4～10μm）にされます。 4037>

ホルマリン以外の固定方法が用いられることもある。 ホルマリン以外の固定法としては、アルデヒド類やアルコール類がある。 固定剤の最適な選択は、アッセイに大きく依存する。 FFPEに代わる一般的な方法として、凍結組織サンプルの作製がある。 この場合、組織は凍結保護培地に埋め込まれて凍結され、固定は切片作成後に行われる。

抗原（エピトープ）の回収

ホルマリンなどの架橋固定剤や、固定液に長時間浸していると、エピトープがマスキングされ、一次抗体がターゲットに結合するのを阻害することが懸念されています。 特にFFPEサンプルでは、実際のIHCを行う前に、化学的架橋を元に戻し、エピトープを「回収」する必要があることがよくあります。 抗原賦活化プロトコルはいくつかあり、主な戦略としては、熱、消化酵素、洗浄剤、またはそれらの組み合わせでスライド組織を処理することが挙げられます。 4037>

Antibody binding

結合分子の質と特異性は、IHCベースの技術にとって重要であり、結合分子の選択は結果、信頼性、そしておそらくアッセイの解釈にも直接影響を及ぼしかねません。 抗体は、IHCに使用される結合分子の中で最も一般的なタイプであり、ほとんどの抗体は目的の分子を適切に検出することができますが、意図した標的に対する特異性が大きく異なる場合もあります。 したがって、高い特異性を持つ抗体は、「標的外」結合や「バックグラウンド」をほとんど生成しないため、「標的上」結合を解釈する際の信頼性が高くなります。 特異性の低い抗体は、オフターゲット結合をより多く生成し、その結果生じるバックグラウンドは、真のオンターゲットシグナルの正しい解釈を妨げる可能性があります。 ポリクローナル抗体とは、標的の異なるエピトープに結合する抗体の混合物で、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体の2つのタイプがある。 ポリクローナル抗体は、同じ標的上の複数のエピトープを検出し結合することができるため、非常に強力な抗体であることが多い。 しかし、結合するエピトープが明確でない場合が多く、また、エピトープ特異性が多様であるため、標的外結合事象やバックグラウンドノイズが発生する可能性が高くなる。 しかし、ポリクローナル抗体の効力は、オンターゲット分子周辺の結合イベントの濃度が潜在的なバックグラウンドノイズを通常上回るため、有利な場合がある。 しかし、ポリクローナル抗体は動物の血清から作られるため、資源に限りがある。 対照的に、モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞株で生産できるため、より継続性がある。 また、モノクローナル抗体は、エピトープ結合の定義が明確であることが多いが、特異性が低い場合や標的エピトープの存在量が少ない場合には、解釈しにくい結果が得られることがある。

結果は、抗体の標的に対する特異性や親和性だけでなく、サンプルに存在する標的上および標的外のエピトープの濃度や利用可能性にも依存するため、各アッセイにおける抗体濃度の注意深い最適化と滴定が必要です。 抗体を過剰に添加すると、オンターゲットエピトープが結合剤で飽和した後、低親和性のオフターゲット結合イベントが増加する可能性があります。 抗体濃度を低くすることで、通常、オンターゲット結合イベントよりも低親和性のオフターゲット結合イベントが稀に発生します。 低親和性抗体を用いてバックグラウンドの低減を図った場合、オンターゲットのシグナルが弱まり、偽陰性となる危険性があります。

IHCベースの技術で時々使用される他のタイプの結合剤分子には、アフィボディ、ペプチド、抗体フラグメントまたは他の小分子がある。

Detection systems

IHCを行う全体の目的は、実験組織内で標的が見つかる場所の視覚表現を得て、できれば異質の細胞集団および/または細胞内局在の間での標的の発現パターンに関する情報も得ることである。 これは図2に例示されており、複雑な組織内の異なる細胞または組織区画を可視化するために、異なる抗体がどのように使用されるかを示している。 標的-抗体相互作用を可視化するためには、観察可能な染色またはシグナルを生成する何らかの検出システムが必要である。 検出システムを実験に導入する最も一般的な方法は、あらかじめ結合したレポーター分子、すなわち酵素や蛍光体を搭載した二次抗体を使用することである。 二次抗体は通常、異なる動物種由来の抗体分子を特異的に標的としている。 例えば、一次抗体がウサギで飼育されている場合、二次抗体は別の動物で飼育され、ウサギの抗体に対して特異的に標的化される必要がある。

食道

の3つです。

	倍率
Hematoxylin staining			抗体染色なし
TP63 CAB000083		核染色
核染色 EGFR CAB000035		膜状染色
G6PD HPA000247		細胞質染色
LAMB2（ラミニン） CAB000053		結合組織

図2.細胞質染色の例 複雑な組織における異なるタンパク質ターゲットの可視化。 4037>

IHC画像（図2）では、4つの異なる抗体を使用して染色したヒト食道の連続したセクションにより、組織内および細胞内区画内の異なるタンパク質発現パターンを直接比較することができます。 上の画像は比較のためにヘマトキシリンでカウンターステインしたもののみである。 p63抗体は、食道上皮の基底部に存在する細胞集団の細胞核を染色する。 EGFR（Epidermal growth factor receptor）抗体は、p63と同じ細胞集団を染めるように見えるが、核の代わりに細胞膜を染める。 G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 抗体は、より広いレパートリーの食道上皮細胞や、結合組織に存在する細胞の細胞質を染める。 Laminin (LAMB2) 抗体は、食道の下にある結合組織の細胞や構造のみを染色します。

FFPE組織サンプルでは、最も一般的な検出方法は、酵素反応を用いて抗体結合部位に着色沈殿を生成させる方法です。 二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）やアルカリホスファターゼ（AP）などの酵素を持ち、3,3′ Diaminobenzidine (DAB) や 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/ p-nitroblue tetrazolium chloride (BCIP/NBT) などの発色剤を、反応部の組織内に沈着する茶色や青みの沈殿物に変化させる能力を有している。 4037>

凍結した組織切片では、正しい波長の光で励起されると特定の色（通常は緑、赤、青）を発する蛍光剤と結合した二次抗体を使用するのが一般的である。 さらに、フルオロフォアは通常、長期間安定ではない。 しかし、蛍光色素を使用する利点は、複数の標的に対する複数の抗体を同一サンプルでアッセイする二重標識実験を簡単に行うことができる点である。 二次抗体は、異なる一次抗体に結合させる必要があり、また異なる蛍光色素に結合させる必要がある。 そして、異なる二次抗体を異なる波長の光で順次励起することにより、別々に観察することができる。 これらの異なる励起結果は別々の画像（またはカラーチャンネル）として保存され、後で重ね合わせてタンパク質の共局在などを推測することができる。

検出のためにレポーターを担持した二次抗体を使用することは、いくつかの二次抗体が単一の一次抗体と結合できることからそれ自体が増幅ステップとなるが、時には実験のシグナルと感度を高めるためにさらなる増幅ステップが望まれることがある。 このような場合、二次抗体は代わりに「リンカー分子」、例えばビオチンポリマーを担持して、後続のステップでより多くのレポーター分子を勧誘することができる。

カウンターステイン

発色剤を用いた免疫組織化学的染色は、コントラストを高めて組織学的特徴の観察を容易にするカウンターステインを適用することでしばしば利益を得ることができる。 FFPEサンプルに使用されるカウンターステインの最も一般的なタイプは、細胞の細胞質を淡い青色で染色し、細胞核をより濃い青みのニュアンスで染色するヘマトキシリンである。 蛍光染色は光学顕微鏡による検出ではないため、通常ヘマトキシリンによる対比染色は行わない。 その代わり、核酸と結合する蛍光色素を加えて細胞核を標識し、蛍光の対染色を得る方法が一般的である。 実際の免疫組織化学反応の後、残るステップは、サンプルの保護と長期保存のためのカバースリップと封入のみである。 4037>

具体例

IHCは研究および臨床の両分野で広く用いられている。 ヒューマン・プロテイン・アトラス（HPA）プロジェクトは、ハイスループットIHCを用いて、多くの組織、がん、細胞におけるヒトプロテオームの大規模マッピングを実現した代表的な例である。 HPAプロジェクトでは、合理化された社内の大規模な抗体作製チェーンにより、特異的な抗体の作製が容易になり、基本的な特性評価と検証を経て、1回の実験で数百の組織コアを含む組織マイクロアレイを系統的に染色するために使用されています。 HPAのIHCシステムは、プロトコルの標準化と機械による自動化に大きく依存していますが、各抗体の最適な滴定の評価は、抗体が組織全体への染色に承認される前に手動で行われます。 染色された各組織コアは、組織や細胞タイプにおける免疫組織化学的染色に関して注釈がつけられ、その後高解像度画像としてウェブポータルで公開され、誰でも自由に閲覧することができる。

臨床の現場では、主に病理学において、医師が組織標本を健康な状態と病気の状態に関して評価し、診断を下し、異なる種類のがんの分子サブタイプを定義するために、IHCが使用されています。 IHCが診断に用いられる具体的な例としては、病理医が転移性腫瘍のサンプルを提示され、原発腫瘍の組織起源が不明である場合である。 このような場合、病理医は、前立腺癌の前立腺特異抗原、または婦人科癌のエストロゲン受容体、または胃腸癌のサイトケラチン20などの組織特異的タンパク質を標的とする異なる抗体のパネルを用いる（Gremelら、2014年）。 大まかな分類がなされると、さらに組織特異的な抗体を用いて、原発巣の起源をより正確に特定します。 この情報は、薬物療法に最適または最も適切な戦略を選択するため、および/または放射線療法および/または手術のために原発腫瘍の位置を特定するために有用である。

参考文献とリンク

がん診断に一般的に使用される抗体：
Gremel G et al.、A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopathology. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255

A review on validating antibodies for IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.癌診断のための抗体の妥当性を検証するためのレビュー。 Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008

Antibodypedia – 公開されている抗体とその様々な用途における有用性のオープンアクセス・データベース:

IHC world – プロトコル、フォーラム、製品、その他：

BioGenexLaboratoriesからIHCを説明するYouTubeクリップ: