Frontiers in Oncology

はじめに

高リスクヒト乳頭腫ウイルス（hr-HPV）への持続感染が、子宮頸がんや前がん病変の必発要因であることが知られています（1、2）。 病因が明らかにされている子宮頸がんは、予防可能性が高い（3、4）。 先進国では、子宮頸がん一次スクリーニングにおいて、hr-HPV検査を単独または細胞診との同時検査で行うようになった（5-8）。 HPVを用いた検診プログラムは、細胞診などの従来の検診方法と比較して、子宮頸がん前がんおよびがんに対する予防効果が高いことを示す証拠があります（9-11）。 しかし、HPV感染のほとんどは自然に治癒する可能性があるため、HPV検査では、特に若い女性において、子宮頸部前癌や癌に進行しない多数の感染を同定してしまう(12)。 したがって，HPV DNA検査は，30歳未満の女性のスクリーニング検査としては推奨されない。 さらに、その後の処置のために紹介されたHPV陽性患者は、不必要な侵襲的介入に苦しむかもしれません。

中国では、2015年に子宮頸がんの新規患者が98,900人、死亡者が30,500人でした(13)。 この悪性腫瘍の増加傾向に歯止めをかけるため、中国政府は2009年から農村部に住む女性を対象に、経済や技術の発展レベルに応じて、VIA/VILI、パパニコロウ（Pap）検査、HPV検査（試験地）を用いた全国無料の子宮頸がんスクリーニングプログラムを提供しました（14）。 しかし、これらのスクリーニング法の性質上、診断精度を向上させる必要がある。 さらに、中国の人口の多さを考慮すると、感度と特異度のバランスがとれた新しいスクリーニング手段を評価する必要がある。

子宮頸がんの疾患特異的分子マーカーは、子宮頸がん前がんを検出するのに、高い感度と高い特異度の組み合わせが得られる。 これらのマーカーの多くは、HPVに関連した発がんメカニズムに基づいて同定されたものである。 HPV RNA検査は、HR-HPV E6およびE7 mRNAの検出を基本としています。 HPV感染の発がん性は、ウイルスのE6/E7オンコプロテインの産生に依存する。 したがって、E6/E7 mRNA転写物の検出は、前がん病変を検出するための特異的な検査の可能性を提供する。

本研究では、中国人女性における高グレード子宮頸部上皮内新生物（CIN）とがんの検出に対するHPV E6/E7 mRNA検査の臨床性能について評価を行った。

材料と方法

参加者と手順

この病院ベースの研究は、中国河南省で2017年4月から12月の間に実施された。 鄭州大学第二付属病院（SAHZU）の婦人科を受診し、コルポスコピーを受けた女性を対象とした。 組み入れ基準は以下の通りであった。 (1）25歳から64歳の女性、（2）子宮頸がんや子宮摘出の既往がない、（3）妊娠または妊娠終了後8週間の臨床症状がない、（4）研究手順を理解し、自発的に参加すること、である。 この研究は、河南癌病院（HCH）の施設審査委員会（IRB）によって承認された。 4889＞子宮頸部剥離細胞は、婦人科検診で女性から入手した。 検体は20mlのPreservCyt®輸送培地（Hologic Inc.、Marlborough, MA, United States）で保存し、4℃で保管した。 その後、婦人科医によるコルポスコピー検査が行われた。 コルポスコピー検査で異常が認められた女性には、病巣標的生検を行った。 コルポスコピー検査が不十分な場合（扁平上皮接合部が完全に見えない場合）には、子宮頸管内掻爬術（ECC）が行われた。 子宮頸部剥離細胞標本は中国医学科学院癌研究所・病院（CICAMS）に搬送された。 検体は，HR-HPV DNA検査とHPV E6/E7 mRNA検査のために，1.5 mlの細胞混合物をEP管に分注した． 剥離した細胞を含む残余のプレザーブはThinPrep細胞診検査（TCT）（Hologic Inc.、マールボロ、米国）に使用した。 細胞診は上級細胞診専門医によるベセスダレポーティングシステムを用いた（15）。

HR-HPV DNA Assay

1.5 ml EPチューブからの400 μl細胞混合試料を用いて，Cobas 4800 HPV assay（Roche, Basel, SUI）で14 hr-HPV types（16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 and 68）に対するDNA検出を実施した． このアッセイは，14 hrHPVのプール結果と，HPV 16および18の個別結果を同時に報告するものである（16）． Cobas 4800はHPV DNAを核酸ハイブリダイゼーション増幅法を用いて，製造元の説明書に従ってPCR法で検査するものである． 各検査で陰性と陽性の品質管理を設定した。 ct値が40より大きい場合、陰性とした。 それ以外の場合は陽性とした。 陽性結果には3つのタイプが含まれていた。 HPV 16、HPV 18、HPV others (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68).

HPV E6/E7 mRNA Testing

1.5 ml EPチューブからの1 mlサンプルを、14時間HPV型からE6/E7 virus mRNA検出用に集約してAPTIMA HPV test (Hologic Inc, Marlborough, MA, United States）の製造元の説明書に従って行った（17）． mRNA抽出，増幅，増幅産物検出の3ステップの試験である． コピー数が1.0以上の場合、陽性と判断した。

病理組織診断

生検とECC組織はSAHZUに送られ、子宮頸部上皮内新生物（CIN）報告システムに従って病理組織診断が行われた。 その後，HCHの病理医がすべてのスライドを検討した。 病理学的診断に矛盾がある場合は、CICAMSに送られ、判定が行われた。 各女性の最終診断は、パネルレビューの最も悪い読みに基づくものであった。 すべての検出と診断のプロセスは盲目であった。

統計解析

最終病理組織診断がゴールドスタンダードとして使用された。 TCT診断で低悪性度扁平上皮内病変（LSIL）以上（LSIL＋）の女性は、液状細胞診（LBC）陽性と判断された。 HPV DNAの結果は、HPVのタイプによって層別化された。 HPV16/18（すなわち、HPV16および/またはHPV18陽性）、HPV-others（すなわち、HPV16およびHPV18を除く12hr-HPV型のいずれかが陽性）、およびHPV-total（すなわち、14hr-HPV型のいずれかが陽性）であった。 陽性率，感度，特異度，陽性適中率（PPV），陰性適中率（NPV）の絶対推定値および95％信頼区間を算出した． HPV群ごとのHPV mRNA発現量の差は、カイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定を用いて算出した。 感度と特異度の差の確認にはMcNemar検定を用いた。 αレベルは0.05とし、p＜3672＞0.05（2サイズ）を統計的に有意とした。

結果

この分析には、合計537人の女性が含まれた。 平均年齢は43.88±10.97歳であった。 LBCの診断結果は 183（34.7％）正常、135（25.1％）意義不明の異型扁平上皮（ASC-US）、22（4.1％）異型扁平上皮はHSILを除外できない（ASC-H）、7（1.3％）、非定型腺房細胞（AGC）82（15.3％）、高悪性度扁平上皮内病変（HSIL）75（14.0％）、扁平上皮癌（SCC）31（5.8％）、adenocarcinoma in situ（AIS）2（0.4%） であった。 病理組織学的診断は，正常298例（55.5％），子宮頸部上皮内新生物グレード1（CIN1）30例（5.6％），CIN2 48例（8.9％），CIN3 111例（20.7％），SCC43例（8.0％）およびAIS7例（1.3％）となった。

Table 1にはHPV型によるmRNAとDNA検出の相関を示した． 両検査の合計一致率は90.7％（95％CI：87.9，92.9），カッパ値0.81であった。 mRNAの陽性率は，HPV16/18，HPV-others，HPV-totalの各陽性女性で，それぞれ91.7％，84.6％，86.4％であった． すべてのmRNA陽性率は，同じHPVタイプ群のHPV陰性女性よりもHPV陽性女性で高かった（すべてp＜3672＞0.001）。

Table 1. HPV型によるmRNAとDNA検出の相関性。

HPVのDNA、mRNA、LBC陽性率は病理組織診断の重症度によって上昇し、それぞれ正常で25.5%、19.1%、11.4%からSCCで100.0%と幅があることがわかった。 AISにおける3検査の陽性率は，それぞれ85.7，85.7，100.0％であった。 CIN3、SCC、AISではこれら3つの検査は同程度の陽性率であった。 しかし，mRNAの陽性率はCIN2診断の女性で相対的に低かった。 HPV16の陽性率は，他のHPV DNA群と比較して，CIN3，SCC，AISで最も高かった． HPV18陽性率は，すべての扁平上皮病変で7％より低かったが，AISではやや高かった（28.6％）（表2）＜212＞＜8740＞表2＜1116＞＜5004＞＜4889＞表2． 病理組織診断の重症度別のHPV陽性率。

表3は、CIN2+およびCIN3+病変の検出における3つの検査の臨床的性能を示したものである。 CIN2+およびCIN3+の検出に対するmRNAの感度はそれぞれ93.8％（95％CI：89.7-96.4）および95.7％（95％CI：91.3-97.9）で，DNAによる検出（CIN2+：95.7％，CIN3+：96.3%）と変わらなかったものの，LBCによる検出（CIN2+：80.4％，CIN3+：88.8%）よりは高感度であった． CIN2+（79.0%）およびCIN3+（70.5%）に対するmRNAの特異度はDNAによる検出値（CIN2+：71.0%、CIN3+：62.8%）より有意に高かったが（p < 0.05）、LBCによる検出値（CIN2+：84.5%、CIN3+：79.8%）よりは低値であった。 CIN2+およびCIN3+を検出するmRNAのPPVはそれぞれ74.0％（95％CI：68.4-78.9）および58.1％（95％CI：52.1-63.9），NPVは95.2％（95％CI：92.0-97.2）および97.4％（95％CI：94.8-98.8）だった＜212＞＜8740＞TABLE 3＜1116＞ ＜3550＞＜4889＞Table 3. CIN2+およびCIN3+病変を検出する検査の臨床成績（%）

表4，5は，年齢層別の3検査の陽性率および臨床成績である。 要約すると、すべての検査は、30歳以上の女性では、若い女性よりも良好な成績を示した。 HPV DNA検査は最も感度が高く，LBCは30歳未満の女性におけるCIN2+およびCIN3+の検出において最も特異度が高かった

表4. 異なる年齢層におけるCIN2+を検出する検査の陽性率と臨床成績。

Table 5.

Discussion

今回の結果では、mRNAテストとDNAティートが90.7％と高い一致率を示した。 HPV DNA、mRNA、LBCの陽性率は病理組織診断の重症度によって上昇し、それぞれ正常で25.5%、19.1%、11.4%からSCCで100.0%であった。 CIN2+，CIN3+のmRNAによる検出感度は93.8％，95.7％であり，DNAによる検出感度（CIN2+：95.7％，CIN3+：96.3％）と同等であった。 しかし，mRNAの特異度（CIN2+で79.0％，CIN3+で70.5％）は，DNAの特異度（CIN2+で71.0％，CIN3+で62.8％）よりも著しく高かった。本検討においてHPV E6/E7 mRNA検査とHPV DNA検査は高い一致度を示した． HPV 16/18 DNA陽性の女性のうち、91.7％がmRNAでも陽性であった。これは、APTIMA HPV検査とHPV DNA検査の全体的な一致率が90％以上であり（17、18）、異なる集団においてHPV DNA検査の陽性率が常に高い（19、20）と報告している他の研究に類似している。 我々は、若い女性よりも高齢の女性で高い陽性率に気づいたが、これは他の研究（21-23）とは若干異なっていた。 この差異は、研究デザイン（すなわち、病院ベースの研究）に起因すると考えられ、一般集団への知見の外挿は制限される。 興味深いことに、不一致率は30歳以下の女性で高かった（25.6％ vs. 8.6％）。 研究により，若い女性ではHPV感染の自然治癒率が高いことが示されており，HPVの統合の可能性が低いことが示唆された（24）

ご存知のように，DNAベースのHPV検査は，HPV DNAの有無を検出する。 しかし、ほとんどのHPV感染は一過性であり、1年以内に自然に治癒し、子宮頸部前癌や癌に進行することはない(25)。 E6/E7 mRNAの発現は、活発に感染している細胞でのみ起こり、CINの発生と進行の間に増加する(26)。 したがって、HPV mRNA検査は、高グレードの子宮頸部病変をより特異的に検出することができると考えられている。 我々のデータはこの仮説を裏付けるものであった。 mRNA検査はDNA検査と同程度の感度を持ち、子宮頸部前癌および癌の検出においてより特異的であることが判明した。 他の研究者も、一次スクリーニング（20）または軽度細胞診異常の女性のトリアージ（27）において、同様の結論を導き出している。 我々の研究では、50人の女性がHPV DNA検査とmRNA検査で不一致の結果を得た。 このうち、DNA＋/mRNA-34人対mRNA＋/DNA-8人が正常またはCIN1と診断され、6人対2人がCIN2またはCIN3と診断されたが、がんでは検査の差は認められなかった。 したがって、HPV DNA 検査を mRNA 検査に置き換えた場合、34 名の女性が不必要なコルポスコピーを受けずに済むが、CIN2 を 4 名、CIN3 を 2 名見逃してしまうことになる。 6 例が見逃されたにもかかわらず、感度は失われないが、特異度は上昇した。 文献的には、CIN2 の 40-60%が 2 年以内に退縮し(28, 29)、CIN3 のすべてが真の前癌病変であるとは限らない(30)。 また、Cookらは、mRNA-/DNA+の女性ではCIN2+の割合が低いことを見出している(17)。 したがって、6人の女性の浸潤癌のリスクは、短い時間間隔では低かった。

我々は、高齢者と若い女性における検査成績も評価した。 年齢別の分析では、3つの検査は30歳以上の女性でよりよく機能することがわかった。 CIN病変を有する若い女性は退縮の可能性が高いという事実に基づき、若い女性には保存的管理を提案する。 HPV感染は若い女性に多いが、その多くは一過性の感染であり、自然に治癒する可能性があることが研究で明らかにされている（31, 32）。 これらの女性におけるHPV感染の多くは短期間であることから、関連する子宮頸部異形成は保存的に管理されるべきであると考えられる(12)。 したがって、HPV DNA検査は偽陽性率が高いため、30歳未満の女性には適切なスクリーニング法ではない可能性がある。 若年女性における細胞診とE6/E7 mRNAの総合的なスクリーニング性能を評価する必要がある。 我々の研究では、30歳未満の女性では、細胞診が最も特異度が高いが、感度はHPV DNA検査より低いというデータが得られた。 しかし，E6/E7 mRNAについては，30歳未満の女性では中程度の性能であり，細胞診よりも感度が高く，HPV DNAよりも特異度が高かったことから，E6/E7 mRNA検査が30歳未満の女性のスクリーニングに有望であることが示唆された

中国食品医薬品局は3種類の予防用HPVワクチン（すなわち，サーバリックス，ガーダジル，セコリン）を承認したが，子宮頸がんの予防はまだスクリーニングに頼っている状況である。 2009年、中国政府は農村部の女性を対象とした全国規模の無料子宮頸がん検診を開始しました。 2015年には、HPV DNA検査が初めてパイロットサイトで一次スクリーニングツールとして使用されました。 しかし、その人口の多さから、HPV DNAを用いた検診では、避けられない巨大な偽陽性が生じ、医療資源の浪費と不必要な不安につながることになります。 mRNAを国の子宮頸がん検診プログラムで使用することで、感度を落とさずに偽陽性を減らすことができると期待されている

本研究ではいくつかの制限に対処する必要がある。 まず、本研究は横断的研究であり、HPV E6/E7 mRNAに関連する病変進行のリスクを評価することができなかった。 しかし、組織学的グレードによってデータを層別化したため、相関性に関する情報を得ることができた。 結論として，APTIMA mRNA検査は，コバス4800 HPV DNA検査と同等の感度と高い特異度で，高グレードの子宮頸部病変を検出することができ，良好な一致を示した． 中国の国家的な子宮頸がん検診プログラムにおいて，感度を落とさずに偽陽性を減らすためにmRNAを使用できる可能性がある。 212>

Data Availability Statement

本研究のために作成されたすべてのデータセットは、論文／補足資料に含まれている。

Ethics Statement

ヒト参加型の研究は、HPV E6/E7 mRNAおよびp16/Ki-67タンパク質の共発現が子宮頸がんリスクの予測に及ぼす役割について審査・承認を受けている。 鄭州大学生命科学倫理審査委員会により承認された。 この研究に参加するために、患者/参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。

Author Contributions

S-KZ は設計と原稿執筆に貢献した。 ZGは原稿の執筆と修正に貢献した。 PW, M-MJ, P-PGは調査およびHPV DNA検査に貢献した。 L-NKとZ-NWはHPV mRNA検査に貢献した。 D-MZは細胞診と組織診に貢献した。 QCとX-QCは統計解析を行った。 X-BSは本試験の構想に協力し、統計解析に助力した。 Y-LQとJ-GZは研究の構想に協力し、原稿執筆を手伝った。 J-GZは研究の実施に協力した。

資金

この研究は、中国国家自然科学基金（助成番号81502475）および河南省科学技術プロジェクト（助成番号172102310067）の支援を受けて行われた。

利益相反

著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で行われたことを宣言する。

謝辞

この研究に関わったすべての女性の参加に謝意を表する。 また、この研究に関連するすべての医師の貢献と、国立がんセンター、中国医学科学院がん病院、北京ユニオン医科大学の協力に感謝する。 また、本研究の要旨を発表する場を提供してくださった第32回国際パピローマウイルス会議（IPVC 2018）にも感謝します（タイトル）。 HPV E6/E7 mRNA test to Detect Cervical High-grade Intraepithelial Neoplasia and Cancerの臨床的性能。 A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session)を発表する場を提供しました。

略語

hr-HPV, high-risk human papillomavirus; VIA/VILI, visual inspection with acetic acid/visual inspection with Lugol’s Iodine solution; Pap, papanicolaou; SAHZU, Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University.略語は鄭州大学第二付属病院。 IRB: Institutional Review Board; HCH: Henan Cancer Hospital; CICAMS: Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95%CI: 95% confidential intervals; ECC: Endocervical curettage（子宮内膜掻爬術）。 TCT, ThinPrep細胞診; CIN, 子宮頸部上皮内新生物; LSIL, 低悪性度扁平上皮内病変; HSIL, 高悪性度扁平上皮内病変; LBC, 液体細胞診; PPV, 陽性予測値.TCT, 薄膜扁平上皮内病変; CIN, 子宮頸部上皮内病変; LSIL, 頚部扁平上皮内病変; HSIL, 頚部上皮内腔; NPV, negative predictive value; ASC-US, atypical squamous cells of undetermined significance; ASC-H, atypical squamous cell cannot exclude HSIL; AGC, atypical glandular cell; SCC, squamous cell carcinoma; AIS, adenocarcinoma in situ.

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