Differential effects on membrane permeability and viability of human keratinocyte undergoing very low intensity megasonic fields

周波数1MHzの超低強度超音波（Ispta 7～16mW/cm2, cavitation threshold, 100mW/cm2よりかなり低い）を照射した際のHaCaT細胞の影響について検討した． 実験は、ESIの図S1に示した医療用セットアップを用い、Ispta、デューティサイクル、超音波処理時間などの処理パラメータを変化させながら行った。 予備実験では、本書に含まれる曝露パラメータの範囲において、USエネルギーの熱放散を除けば、温度は一定（1℃以内）であることが指摘された。 さらに、この処理では、研究した効果のUS波のデューティサイクルへの有意な依存性は見られなかった。 これらの観察は、1MHzでの低いUS吸収と一致している。逆に、US減衰係数が周波数に比例することから、熱効果とデューティサイクルは、より高い周波数にさらされた細胞や組織に影響を与える可能性がある23,31>

結果は、最初に2つの関連する暴露パラメータ、超音波処理時間とIsptaを別々に考慮して示される。 細胞膜の構造的・物理的変化（透過性、取り込み効率、内包された分子の最大サイズ）を分析し、対応する細胞障害および炎症パターンの活性化の可能性に相関させる予定です。 その後、結果は超音波照射量（Isptaと照射時間の積、すなわち超音波照射中に試料に入射する音響エネルギーの表面密度として定義される）の観点から解釈されます。 実際に、研究された現象はこの量に依存しており、これにより、生物学的損傷を無視できる一過性のSPが発生する曝露パラメータの範囲を特定することができた。

US曝露時間の影響の分析

低強度の1MHz USによって引き起こされるHaCaT細胞の膜透過性の変化は、緑色蛍光プローブカルセインの取り込み効率の観点から評価された。 無傷の膜はカルセインに対して不透過性であるため、カルセインはSPの信頼できるマーカーとなる。 緑色陽性細胞の割合は、セクション2.5に従ってフローサイトメトリー分析によって定量化された。

膜透過性のUS曝露時間に対する感度を評価するために、非常に低いUS Isptaが使用された。 注目すべきは、すでに7±1mW/cm2のIsptaで、適切な露光時間によって膜透過性に大きな影響を与えることができることである。 図1に、HaCaTとNIH-3T3細胞をIspta ~7 mW/cm2で5′、15′、30′、45′超音波処理したときのフローサイトメトリー結果を示す（それぞれ赤い三角形と青い正方形）。 予想通り、低い超音波照射時間（ソノポレーションの閾値以下）後の細胞株間の比較では、カルセインの親和性はほとんどなく、その差（HaCaT細胞で最も高い）はそれぞれの膜組成と透過性の特徴を説明するはずである。 より重要なことは、両細胞株とも15分間の暴露から取り込み効率が著しく上昇することである。これは、（6.3 ± 0.9）J/cm2 の超音波照射量に相当し、SPプロセスの活性化を示唆するものである。 図1のベストフィットによると、露光時間が長い場合、我々の実験は、HaCaTとNIH-3T3の両方の細胞でUSによって誘導される同一の取り込み速度（線形回帰の傾き（％/分）1.3±0.2と、HaCaTとNIH-3T3で、それぞれ1.4±0.2）で、取り入れ効率と暴露時間間の線形相関を指摘している。 これは、SPによる取り込み効率の向上が細胞系列に依存しない現象であることを意味することになる。

さらにSPプロセスを調べ、内在化を特徴付けるために、処理したHaCaT細胞は蛍光顕微鏡で評価された。 フローサイトメトリーの結果と一致して、5′間超音波処理したサンプルは、対照（未処理）サンプルに関して、膜透過性に有意な変化を示さないが、15′から、すべての細胞が蛍光を示したわけではないが、増加する取り込み効率が観察される（図2およびESIの図S2に示すとおりである）。 それに伴い、対照試料と比較して、細胞の密度が低く、接着しているように見え、タイトジャンクションが緩んでいることが示唆される。 図2の代表的な画像は、細胞内のカルセインの不均一な局在を示唆しており、実際、共焦点蛍光顕微鏡により、HaCaT細胞内でプローブの周辺分布と内部分布を明確に区別できた（図3の画像と3D再構成を参照）。 さらなる詳細な画像はESIのセクション3に示されている。 プローブが細胞膜周辺の小胞体ネットワークに局在する周辺部と、プローブが細胞質内に拡散して核形質を含む細胞全体に均一に分布する強い蛍光を引き起こす、30分露出後に顕著に示されるもう1つのレベルである。 カルセインのストークス径は約1.36 nmであり、核内輸送は拡散障壁によって妨げられないことに留意すべきである29。 セクション3.2および3.3で報告されているより完全な分析により、露光のUS線量およびプローブの分子量が、取り込みを決定する主要な要因であると結論付けることができる。 15′（A）、30′（B）、45′（C）で超音波処理した細胞の低強度透過位相コントラスト画像とともにFITC蛍光を取得し、位相コントラスト（左）および蛍光（右）で取得した45′（D）の細胞の詳細では、蛍光プローブの2レベルの取り込み（サイトゾルでの拡散および生体膜への局在）が明らかである。

赤色PI蛍光プローブに基づくさらなるアッセイは、超音波処理した細胞の本来の膜透過性の回復を評価するために行われた（セクション2.3も参照のこと）。 PI の内在化は、細胞毒性プロセスの活性化を示す。 緑色と赤色の色素が細胞内で共局在化することは、超音波処理後の細胞膜回復プロセスの失敗を意味する。 一方、赤色の蛍光がなく緑色の蛍光が観察された細胞は、US処理中に膜SPが発生し、フィールドスイッチング後にその回復が成功したことを示す。 代表的な共焦点蛍光画像をFig.4に示す。 2つの色素の共局在化は、15分間処理した細胞では見られないが、30分間暴露した後にはほとんど観察されない（ESIの図S5）。 フローサイトメトリーで確認したところ、一貫して、生存率の正味の損失は〜5％であることが明らかになった。 19±3）J/cm2の線量に相当する45分間超音波処理した細胞では、共局在化がより明確に現れ（図4Bの白矢印参照）、より顕著な生存率の低下が生じた（フローサイトメトリーで確認したところ、〜10％であった）。 これらの結果から、Isptaを固定した場合、より長い曝露時間、より高い投与量に相当し、膜構造に不可逆的な変化が生じ、その結果、細胞毒性反応が生じることが示唆された。

Analysis of the influence of US intensity

The effect of varying the intensity of applied US field on the membrane permeability is analyzed after 15′ of exposure, enough to exclude effects induced by a long-lasting sonication. 我々の研究では、US強度はIspta = (7 ± 1) mW/cm2とIspta = (16 ± 1) mW/cm2の間の範囲にあり、キャビテーション閾値よりかなり低かった24。 セクション 2.3 および 2.5 で述べたプロトコルに基づき、異なる分子量（MW = 10、40 および 70 kDa）の FITC 標識デキストランを使用して、各 US 強度について、異なる分子サイズに対する膜透過性の誘導を特徴付けることができ た。 この手順により、ソノポアの大きさを評価することができる。 カルセインと同様に、デキストランは未処理の細胞にはほとんど取り込まれないが、キャビテーションUS領域では、FITC標識デキストランの細胞への取り込みが、SPとエンドソーム輸送の促進の両方により強く増加する30。 この点で、図5に報告されているフローサイトメトリー測定の結果は、サイズに依存した取り込みを明確に示している。この現象は、活性エンドサイトーシス効果の併存を排除し、文献22によれば、低強度トリガーSPが、細胞膜を通じたデキストラン分子の輸送に関わる主要機構として示唆するものである。 具体的には、SPによる取り込みは閾値Isptaによって特徴付けられ、取り込まれた分子の分子量の増加とともに直線的に増加することが確認された。 この閾値以下では、処理細胞の取り込み効率は非曝露細胞のそれと同程度である。 閾値Isptaの値をTable 1に示す。 閾値以上の強度の場合、取り込み効率は最大になるまでIsptaの増加とともに増加する。 10 kDaのデキストランでは、その後、わずかに減少してプラトーに達した。 高強度における取り込み効率の低下は、死細胞の数の増加によって説明できる。死細胞は、リンス時にサンプルから除去され、フローサイトメトリー分析に寄与しない。 さらに、アポトーシス過程の活性化により、色素の内包が妨げられる可能性もある。 注目すべきは、Ispta = 15 mW/cm2の場合、この値はキャビテーションの閾値よりはるかに低いものの、細胞はストークス径が約12 nmの70 kDaデキストランを内包することができることである。 この値は、膜に生成されるソノポアの最小サイズの推定値として捉えることができる。 図S6（ESIのセクション4）には、閾値Isptaにおけるデキストランの取り込みをPIテストと共に示す代表的な蛍光画像のセットが報告されている。

PIの内在化はIspta = 15 mW/cm2 (exposure dose 13.5 J/cm2) で著しい細胞毒性応答を指摘する。 Udroiuら13が同様の実験条件で報告したように、NIH-3T3細胞では、1MHz USへの曝露強度と時間に依存して、小核の発生率がわずかながら有意に増加することも確認された。 これらの観察から、膜 SP に伴う生物学的効果をよりよく理解するためにさらなる研究が必要であることが示唆され、したがって、US 強度の関数として超音波処理細胞の生物学的反応の研究が行われた。

非常に低い US 強度で引き起こされる SP による「膜傷」に対する生物学的反応は、セクション 2.5 で述べた AnnexinV および PI を組み合わせた測定法を用いて、細胞死を評価し徹底的に特徴付けられた（ESI のセクション 5 も参照されたい）。 また、慢性炎症と癌を結びつけるサイトカインである遺伝子IL-6の発現を評価した33,34。 フローサイトメトリー解析の結果を、細胞百分率で表し、図 6 に報告する。 細胞生存率は、15回の処理中、主に維持される（>90%）が、それにもかかわらず、Ispta = 9 mW/cm2から、初期のアポトーシス細胞の増加を伴う、わずかな減少が起こる。 Ispta＝14mW／cm2では、かなりの割合の壊死細胞が観察され始め、Ispta＝16mW／cm2では、壊死のわずかな減少に対応して、後期アポトーシスも細胞死に寄与する（ESIの図S7中の代表フローサイトメトリドットプロット）。 IL-6遺伝子の発現はRT-PCRによって決定された（図7）。 Ispta ≦15 mW/cm2 ではアップレギュレーションは観察されなかったが、16 mW/cm2 での処理では未処理の細胞に比べてこの遺伝子の過剰発現が誘導された。

これらの結果は、16mW/cm2のIspta閾値と15分間の超音波処理から始まる、USによる膜損傷は、細胞生存率を下げるだけではなく、炎症関連遺伝子IL-6の過剰発現を介して、炎症反応を誘発し得ることを示唆している。 いくつかの研究により、炎症が癌などの疾患の病因や進行を促進する役割が認められているため35,36、炎症パターンに関連する側面をよりよく特徴づけるためにさらなる調査が必要である。

超音波照射量の影響の解析

照射中に細胞に与えられるエネルギーという観点から、適用されたUSフィールドと観察された生物学的効果の関係を定量的に分析するために、各処理について超音波照射量を強度Isptaと照射時間の積として計算しました。 得られた値は表2に報告されており、観察された生物学的効果は背景色で識別されている。 その結果、膜SPは約6.3J/cm2の閾値から発生することが示唆された。 さらに、ソノポアの大きさは超音波照射量に関係することがわかった。 10.8J/cm2以上の線量では、処理細胞の生存率の低下とそれに伴う初期アポトーシスが観察され、14.4J/cm2からは後期アポトーシス、ネクローシス、IL-6の過剰発現が見られるようになった。

この線量、およびIspta 16 mW/cm2は、~0.02 MPaの負のピーク圧に相当することを強調したい。 この値は、これまでに提案された安全な曝露しきい値 (1 MHz での機械的指数 ~0.2-0.3) より 1 桁低いが、細胞膜/水界面に機械的ストレスを誘発するには十分高いと思われる。 この点で、我々は、超音波照射量（固定US周波数）の情報を提供することにより、US曝露に対する細胞応答の特徴付けをより完全な指標とし、ひいては、生物学的損傷を無視できる一過性のSPが発生するパラメータの範囲を正確に特定することができると確信している。

我々の結果が生体内に与える生物学的影響を理解するための非常に重要なステップは、多層化したケラチノサイトや血液脳関門内皮細胞からなるヒト組織などの三次元生体システムに対してUS曝露を行うことである。