00:00:07.25Hi my name is Jennifer Doudna from UC Berkeley
00:00:09.26and I’m here to tell you about how we uncovered
00:00:12.25Hi my name is jennifer Doudna from UC Berkeley00:00:12.26Hi have a Breakovered
00:00:12.26a new genome engineering technology.
00:00:15.07This story starts with a bacterial immune system
00:00:20.12th that means understanding how bacteria
00:00:22.14fight off a viral infection.
00:00:24.26It turns out that many of bacteria
00:00:28.26th is a lot of the bacteria
00:00:28.12a new genome engineering technology.その結果、多くの細菌はその染色体に
00:00:30.09を有しており、これがここでご覧いただいているものです
00:00:32.15黒いダイヤモンドで示した繰り返しの配列は、
00:00:36.18と、配列の間に挟まれた
00:00:40.この配列はウイルスに由来するもので、微生物学者
00:00:46.20が細菌ゲノムの配列決定を行っている際に注目しましたが、これらの配列の機能が何であるかは誰もわかりませんでした
00:00:50.10。その結果、DNA修復のような興味深いことを行う酵素と相同性を持つタンパク質
をコードする一連の遺伝子と一緒に出現する傾向があることに気づきました。12そこで、このシステム
00:01:14.04は、CRISPR
00:01:16.08（この種の反復性遺伝子座の頭文字）と呼ばれるようになり、これらのCRISPRシステムは、実際に
00:01:22.というのも、このCRISPRシステムは、
00:01:26.00、バクテリアの後天性免疫システムであり、ウイルスから配列を統合し、
00:01:32.07、感染から細胞を保護するために使用できるかもしれないのです
00:01:35.この仮説は興味深く
00:01:39.11、2000年代半ばに
00:01:41.18が発表された直後から、私たちはこの研究に携わりました
00:01:44.その結果、その後数年間
00:01:55.17に明らかになったのは、実はこれらのCRISPRシステム
00:01:58.そのため、この時点まで、細菌が
00:02:04.24に適応する方法を実際に持っていることを誰も知りませんでした
00:02:08.08 細胞内に侵入したウイルスに対して
00:02:10.しかし、これはその方法の一つで、
00:02:12.14、この例で示したように、細胞内に侵入したウイルスから注入された外来DNA
00:02:15.17を検出することが含まれています
00:02:18.04。そして第二段階として
00:02:33.27があり、これはCRISPR RNA biogenesis
00:02:38として示されています。このCRISPR配列は、細胞内で実際に転写され
00:02:42.20、RNAの断片となり
00:02:45.15、その後CAS遺伝子によってコードされるタンパク質とともに使用されます
00:02:52.23.これらのCRISPR関連遺伝子
00:02:54.01は干渉複合体
00:02:58.12を形成し、これらのRNA分子の形状の情報を利用して、ウイルスDNAの一致配列とベースペア
00:03:04.08することができるのです。
00:03:07.18 つまり、バクテリア
00:03:10.12は、侵略者
00:03:13.06を捕まえて配列情報を敵に回す、非常に気の利いた方法を思いついたのだ。私たちは長い間
00:03:23.09、RNA分子
00:03:26.03が、細胞がどのようにタンパク質
00:03:32.00の発現を制御するかを理解することに非常に興味をもってきました。
00:03:35.05 この経路も非常に興味深い例だと思い、
00:03:37.18 この経路が作動する基本的な分子メカニズム
00:03:42.24の研究を始めました。
00:03:45.01 2011年に私はある学会に行き、
00:03:49.23の写真に写っている同僚のエマニュエル・シャルパンティエと出会いました。この研究室は微生物学の問題に取り組んでおり、特に人間の病原菌である細菌
00:04:02.11に関心を持っています。そして、この虫で興味深かったのは、この虫がCRISPRシステムを持っていて、
00:04:16.25という生物
00:04:19.この遺伝子は、CRISPRシステムの機能に必要であることが遺伝学的に示されていた
00:04:26.09、
00:04:28.16 Streptococcus pyogenes,
00:04:30.12 Cas9というタンパク質をコードする単一の遺伝子があったのです。しかし当時は、そのタンパク質の機能が何なのか、誰も知りませんでした。
00:04:43.17 そこで、このプロジェクトの主要な人々
00:04:45.20が、この写真に写っています
00:04:48.00中央はマーティン・ジネク
00:04:50.03で、私の研究室で博士研究員を務めています
00:04:52.その隣の青いシャツがKryztof Chylinskiで、彼はEmmanuelleの研究室の学生
00:04:57.20で、
00:04:58.26と、この2人、右端がInes Fonfara、
00:05:00.21.その結果、
00:05:13.06 Cas9は実に魅力的なタンパク質であることがわかったのです
00:05:16.このタンパク質は、DNA
00:05:19.28と相互作用して、ガイドRNA
00:05:25.06と一致する配列でDNAの二本鎖切断
00:05:27.02を生成する能力を持っているのです。このスライドでご覧いただいているのは、ガイドRNA
00:05:30.10とオレンジ色のガイドの配列が、二重らせんDNA
00:05:37の一方の鎖と
00:05:34.18で塩基対を形成している様子です。また、このRNAは非常に重要なことに、tracrと呼ばれる2番目のRNA分子
00:05:42.09と相互作用して構造を形成し、Cas9タンパク質
00:05:46.03を呼び出すので
、この2つのRNAと単一のタンパク質
00:05:50.00が必要なんです。このタンパク質が細胞内の通常ウイルスDNA
00:05:58.11を認識し、タンパク質
00:06:01.13がこれを切り刻むことができるようにするために必要なものです
00:06:02.
00:06:05.24 このことが分かったとき、
00:06:08.14 私たちは考えました。「もっとシンプルなシステムを実際に作り出すことができたら、
00:06:10.26 すごいことではないだろうか」
00:06:13.この2つのRNA分子を結びつけて、1つのタンパク質
00:06:20.16と1つのガイドRNAからなるシステムを作れば、自然界が成し遂げたように
00:06:22.02になるのではないか。28そこで考えたのが、基本的に
00:06:25.17、スライドの奥に見えるこの2つのRNAを、
00:06:29.29、そして基本的にそれらを連結して、
00:06:35.04シングルガイドRNAと呼ぶものを作ることでした。そこで研究室のMartin Jinekがその構築物を作り
00:06:38.25、非常に簡単な実験
00:06:44.22を行って、本当にプログラム可能なDNA切断酵素
00:06:49.18ができたかどうかをテストしたのです。このガイドRNAは、
00:06:59.24にある円形のDNA分子
内の異なる部位を認識する短い単一のガイドRNAを生成し、
00:07:00.21に設計されています
00:07:03.その結果、
00:07:10.16にプラスミド、つまり円形のDNA分子を採取し、
00:07:13.21に2種類の制限（または切断）酵素でインキュベートすることにしました。この写真では
00:07:25.05と
00:07:26.12という灰色の枠の中のDNAの上流を切断する
00:07:27.19と、2番目の部位は
00:07:31.また、非常に単純な実験ですが、
00:07:37.19ではこのインキュベーション反応
00:07:39.これはアガロースゲル
00:07:47.29で、切断されたDNAの分子
00:07:49.16を分離することができます
00:07:51.そして、これらの反応レーンのそれぞれで
00:07:54.22、この二重消化プラスミドから
00:07:58.12、異なるサイズのDNA分子が放出されていることがわかりますが、これはDNAのサイズ
00:08:03.16のことであります。そのため、この実験は本当にエキサイティングな瞬間で、
00:08:12.29実際には非常にシンプルな実験であり、
00:08:15.その結果、私たちは本当にプログラム可能なDNA切断酵素を手に入れ
00:08:22.02、短いRNAの断片を使ってそれをプログラムし
00:08:24.15、あらゆる二本鎖DNA配列を切断できる
00:08:28.03という、「あちゃ～」と思う瞬間が訪れました。このように、プログラム可能な酵素
00:08:30.23、任意の配列で二本鎖DNA切断
00:08:36.01を生成する酵素について我々が興奮した理由は
00:08:39.その結果、
00:08:45.13のように、細胞には二本鎖DNAの切断を修復する方法があり、それが変化
00:08:52.26につながることがわかりました。このスライドは、二本鎖切断が生じた後
00:08:58.20が、これを行うあらゆる種類の酵素
00:09:01.14によって、DNA中のゲノム情報
00:08:05.02に変化を与えることを示しているもので、 00:09:04.12.このような二本鎖切断は、2種類の経路
00:09:13.15によって検出・修復されるのですが、ひとつは左側の非相同末端結合
00:09:17.26で、
00:09:20。この場合，DNAの末端は化学的に結合され
，通常は切断部位に小さな挿入または欠失
を導入して
00:09:26.18に戻ることになる
，00:09:29.また、右側の
00:09:32.01は、修復が起こるもう一つの方法
00:09:34.00で、ドナーDNA分子がそれらの
00:09:43.14と一致する配列を持つ、相補性指向性修復
00:09:39.22を経由して行われたものであり、この場合
00:09:37.22は、
0時00分00秒に終了します。その結果、
00:09:45.12 の二本鎖切断部位を挟んで
00:09:48.05 がゲノムに組み込まれ、
00:09:50.10 の切断部位に新しい遺伝情報 00:09:54.06 が導入されることになりました。このため、多くの科学者が
00:09:59.04、あるいは
00:10:03.05科学者や研究者が
00:10:06.12二本鎖切断を目的の部位に導入できる技術があれば、と考えたのでした
00:10:09.04.その結果、
00:10:12.12と、現在利用可能なすべてのゲノム解読データ
00:10:14.21を合わせると、
00:10:16.10細胞の全遺伝配列
00:10:18が判明するのです。また、例えば病気の原因となる突然変異がどこで起きたか
00:10:21.20が分かれば、
00:10:23.20のような技術を使って、突然変異を修正するDNAを導入することができます
00:10:31.この技術の威力は、
00:10:38.28つまり、
00:10:41.20この種の二本鎖切断
00:10:43.を作り出すことができるということなのです。というのは、Cas9をプログラミングすることによって、科学者として選んだ部位で、
00:10:46.17を生み出し、
00:10:48.13に、細胞が修復して、これらの切断部位に
00:10:51.04ゲノム変化を導入できるようにするためです
00:10:54.しかし、課題はそもそもどのようにして切断を発生させるかであり、そのために様々な研究室で
00:11:00.09の異なる戦略が生み出されてきました
00:11:03.24。そのほとんどは、
00:11:08.21ここで2つの具体例をお見せしましょう
00:11:10.17一つはジンクフィンガーヌクレアーゼと呼ばれるもので、もう一つはTALエフェクタードメイン
00:11:15.02これらは両方ともプログラムできる方法です
00:11:18.これは、タンパク質によるDNA配列の認識
00:11:23.29に依存するため、これらはタンパク質
00:11:26.06であり、モジュール化されて生成することができます
00:11:29.06。というのも、このタンパク質はモジュール化されており
、異なるDNA配列を認識するために、異なるモジュールの組み合わせで
00:11:31.22
00:11:34.03 テクノロジーとして機能しますが
00:11:37.18 そのためには多くのタンパク質工学
00:11:40.24
00:11:43.43
本当に興味深いのは、そのようなタンパク質工学が必要な点でしょうか
00:11:43.01。このCRISPR/Cas9酵素について
00:11:46.11は、RNAプログラムされたタンパク質であるため、1つのタンパク質で
00:11:54.27切断したいDNAのあらゆる部位に使用することができます
00:11:56.00。そのため、タンパク質ベースの認識
00:12:03.06に頼るのではなく、DNA
00:12:06.04RNAベースの認識
00:12:08.に頼っているのです。その結果、
00:12:11.03は、
00:12:12.18のシステムであり、
00:12:15.15は、分子生物学の基本的なトレーニングを受けていれば誰でも使える
00:12:19.00であることを示しています。このシステムは、
00:12:20.29 を利用して、ゲノムエンジニアリングを行うことができます
00:12:22.20。したがって、これは本当に、
00:12:26.06 重要かつこれまで欠けていた要素 00:12:29.03 を埋めるツールなんだと私は思います。その中にはDNAの配列を決定しその構造を調べる能力
00:12:36.00だけでなく、1950年代から二重らせんについて
00:12:39.24を知っていること
00:12:42.そしてここ数十年の間に、制限酵素
00:12:46.09やポリメラーゼ連鎖反応
00:12:49.09といった酵素を使って、特定のセグメント
00:12:52.00を分離・増幅できるようになったのです。その結果、
00:12:55.10は、
00:12:57.15ゲノムエンジニアリングを可能にする技術であり、世界中の研究所が利用できる
00:13:03.13であった。このように、
00:13:05.08は、2成分系
00:13:10.11の技術の概要であり、認識にはRNA-DNA塩基配列
00:13:14.16に依存しており
00:13:15.21は重要で、その方法は
00:13:18でありました。このシステムが機能することで、
00:13:19.28は実はとても簡単で
00:13:21.18多重化
と呼ばれることを行うことができるのであり、つまり、
00:13:28.00と複数の異なるガイドRNA
でCas9をプログラムできるのであり、0:13:29.08, 0:13:24.08
0:13:28.00その結果、1つの細胞で複数の切断を生成し
00:13:30.19、染色体の大きな部分を切り取って
00:13:35.01、1回の実験でそれらを削除するようなことができるようになりました
00:13:38.25 その結果、本当に爆発的な
00:13:42.世界中の多くの研究所がこの技術を採用し、非常に興味深い
00:13:48.08と創造的な
00:13:49.15アプリケーションの種類
00:13:53.03に利用されています。
00:13:54.24
00:13:56.11 00:13:57.14
00:14:00.07
00:14:01.08
00:14:04.08
00:13:54.25
00:13:54.24
01: 01: 01.02
Cas 9に関する我々のオリジナルを発表いたしましたが
00:13:04.その時点まで、CRISPR生物学に関する研究はほとんど行われておらず
00:14:08.18、非常に小さな分野でした
00:14:12.19、そして、
00:14:13.2013年に始まり、
00:14:16.09から現在まで、これをゲノム工学技術として使用している研究所から、
00:14:20.16という信じられないほどの爆発的な数の論文が発表されています
00:14:21.04。5971>00:14:26.25 基礎科学者として、基礎研究プロジェクト
00:14:29.22として始まったものが、
00:14:31.12から、あらゆる種類の
00:14:35を可能にする技術に変化するのを見て、本当にとても刺激を受けているのです。この技術を使って行われているいくつかのこと
00:14:42.17を紹介して終わりにしたいと思います
00:14:44.17ですからもちろん左側
00:14:47.そのため、左側には、モデル生物
00:14:53.03や、細胞の挙動を研究するために実験室で培養される様々な種類の細胞株
00:14:55.02の工学によって今できる基礎生物学がたくさんあります
00:14:58.23.しかし、バイオテクノロジーの分野では、植物
00:15:05.15や様々な種類の菌類に的を絞った変化を与えることができ、様々な種類の産業用途
00:15:07.11に役立つ可能性があるのだそうです。そしてもちろん生物医学の分野でも
00:15:12.14、この技術をツールとして使い、人間の病気に対する新しい治療法
00:15:21.06を生み出す可能性に多くの関心が集まっているのですから、これは
00:15:23．また、このスライドは、
00:15:30.20 を示しており、今後、
00:15:33.5971>00:15:36.20 と創造的な方向性
00:15:39.03 が、学術研究機関
00:15:43.19 でも、商業研究機関
00:15:45 でも、さまざまな研究室で見られるようになりつつあるのです。その多くは、2年前にさえも想像できなかったものです。また、様々な団体から多大な資金援助を受けてきました
。