ペプチド生合成に関わる多くの酵素が特定されている
前駆体処理の最も多いステップと関わる酵素は図18-5に示すとおりである。 関与するエンドプロテアーゼはプロホルモン変換酵素1および2（PC1およびPC2）、エキソペプチダーゼはカルボキシペプチダーゼE（CPE、CPHおよびエンケファリン変換酵素ともいう）、α-アミド化酵素はペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシダーゼ（PAM）である。 神経ペプチドの生合成には、シグナルペプチドの切断、ジスルフィド結合の形成、N-結合型およびO-結合型オリゴ糖の付加とその後の修飾、リン酸化、硫酸化など、神経ペプチドに特有でない段階が多く存在する。 図18-3に示すように、翻訳後段階の多くは、成熟した神経ペプチドが軸索を下ってLDCVのシナプスに向かう間に起こる。 神経ペプチド生合成の後期段階（図18-5）は、神経細胞と内分泌細胞に特有のものである。
Figure 18-5
ペプチド前駆体から生物活性ペプチドへとつながる連続した酵素的な段階。 左の神経ペプチドY（NPY）前駆体は、右の大密集小胞（LDCV）の酵素によって順次処理される。 ER, endoplasmic reticulum; (more…)
神経ペプチド生合成の主要酵素には、エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、ペプチドの末端を修飾する酵素が含まれます。 酵母のプロα-mating factorを切断してフェロモンα-mating factorを4つ生成するエンドプロテアーゼKex2pの発見と特性解明は、哺乳類のプロホルモン変換酵素であるfurin, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC, PACE4 の発見の鍵になったのでした． これらのプロホルモン変換酵素は細菌のスブチリシンと相同性を持ち、触媒作用に関与する3つの重要なアミノ酸（図18-5ではD、H、Sと表記）からなるAsp-His-Ser触媒トライアドを有している。 それぞれのプロ領域（図18-5）は、プロテアーゼが正しく折り畳まれるために生合成中に存在しなければならないが、活性化されたプロテアーゼを得るためには除去されなければならない。 PC1とfurinの場合、プロ領域の除去は生合成後数分以内に酵素が小胞体にいる間に起こり、自己触媒的な事象である可能性が最も高い。 他のプロホルモン変換酵素の場合、プロ領域の除去はもっと遅い。 活性型PC2の発現にはペプチド7B2（図18-5）の共発現が必要であり、これはシャペロン機能を果たすようで、PC2が分泌顆粒に沈殿するまでPC2のエンドタンパク質分解活性の発現を妨げる可能性もある。 他のプロホルモン変換酵素に対応するシャペロン／阻害ペプチドは同定されていない。
神経ペプチド処理に最も明確に関与する哺乳類エンドプロテアーゼはPC1とPC2で，分泌顆粒に存在し，発現は神経細胞と内分泌細胞に限られているCa2+依存性プロテアーゼである (Fig. 18-5)． このエンドプロテアーゼファミリーの他のいくつかのメンバーは、より広く発現しているが、さらに他のメンバーは、神経細胞や内分泌細胞とは異なる限られた場所で発現している。 例えば、フリンは事実上すべての細胞に存在し、主にトランスゴルジネットワークに局在している。フリンは、ELH、神経成長因子、副甲状腺ホルモン前駆体の最初の開裂や、インスリン受容体前駆体の開裂による受容体の活性αβ二量体の生成などペプチド機能において重要な切断を触媒している。 フリンはまた、PC2やCPEなどの他のプロセシング酵素の活性化にも役立っている。
PC1 とPC2 は、ペプチド前駆体中の塩基性アミノ酸の特定の対で切断する。 Lys-Arg、Arg-Arg、Lys-LysおよびArg-Lysである。 PC1はプロソマトスタチンやプロコレシストキニンのような前駆体に存在する選択された1つのArg部位での開裂も触媒することがある。 PCによるLDCVの開裂は厳密に制御されており、多くの場合、非常に整然とした形で起こる（図18-6）。 POMCの最初の切断は1時間以内に起こるが（図18-6、ステップ1および2）、他の切断は数時間後にのみ起こる（図18-6、ステップ6および7）。 プロペプチドのエンドプロテオ分解は、しばしばペプチド生合成処理における律速反応である。
Figure 18-6
プロ・オピオメラノコルチン（POMC）前駆体の処理は順序よく、段階的に進む。 POMC前駆体の切断は7つの部位で行われ、そのうちのいくつかは組織特異的な反応である。 丸で囲った数字はその時間的順序を示す（詳細）
PC1、PC2、furinがニューロンや内分泌細胞で発現して触媒する切断のパターンは、精製酵素を用いた試験管アッセイで見られる切断のパターンよりはるかに選択的である。 例えば、プロホルモン変換酵素は通常モデルペプチド基質の一対の塩基性残基のCOOH-末端で開裂するが、細胞内ではPOMC開裂の場合のように、塩基性残基が分離し、結果として生じる2つの成熟ペプチドに残る一対の塩基性残基の中央部で開裂することもある（図18-6） 。 LDCVのCa2+濃度と内部pHは、神経細胞や内分泌細胞がLDCVのエンドプロテアーゼ活性を調節するために用いる2つの変数であると考えられる
神経ペプチド生合成に関与する追加のエンドプロテアーゼが示されるかもしれない。 その有力な候補は、酵母のアスパルチルプロテアーゼ-3（YAP-3）の哺乳類ホモログとN-アルギニン二塩基（NRD）変換酵素である。 プロ心房性ナトリウム利尿因子（proANF）はLDCVに貯蔵され、成熟したANFは心房細胞から循環器系に放出されます。 プロANFのプロセシングは、プロANFのArg1残基の後で切断されるため、PC1やPC2は心臓に存在しないため関与できない。 プロホルモン変換酵素によって生成されたペプチド中間体のCOOH末端から塩基性残基であるLysまたはArgを除去するものである。 この酵素は、組織への分布と基質特異性、そしてグアニジノエチルメルカプトコハク酸 (GEMSA) による特異的阻害により同定された。 CPE は Co2+および Zn2+で活性化される酵素で、通常は酵素の成熟過程で除去される短いプロレ ギオンを持つ。プロホルモン変換酵素とは異なり、CPE はプロレギオンが付いたまま活性化される。 CPEはプロホルモン変換酵素と異なり、プロレギオンが付いたまま活性化する。COOH末端に塩基性残基を持つペプチド中間体は組織やLDCV抽出物中に極めて低濃度で検出されることから、ペプチド処理のカルボキシペプチダーゼ機能は通常律速されないと考えられている。 近年、カルボキシペプチダーゼの存在が確認され、特にCPDは3つのカルボキシペプチダーゼドメインを持つ膜型酵素であることがわかった。 CPE とこれらのカルボキシペプチダーゼの生体内における神経ペプチド処理に対する相対的な重要性は不明である。 塩基性残基のペアでの切断がペアの真ん中になることがあることを考えると、アミノペプチダーゼがLDCVに見つかると考える十分な理由がある。
PAMはほとんどすべてのLDCVに見られる二機能性酵素である（図18-5） 。 PAMはペプチド基質のエンドプロテオティック切断とエキソペプチダーゼ作用の後，COOH末端のGly残基が露出したときに作用し，ペプチジル-Glyを対応するペプチド-NH2へ変換する． 既知の生理活性ペプチドの約半数はα-アミド化されており、一般にα-アミド化は生物学的な効力に極めて重要である。 ペプチジル-Glyやペプチド-COOHは生理的な濃度では通常不活性である。 α-アミド化反応の第一段階はペプチジルグリシンα-水酸化モノオキシゲナーゼ（PHM）によって行われる。PHMは二重機能性PAMタンパク質のNH2-末端部分である。 PHMは2つのCu2+原子を結合し、還元と酸化のサイクルを行うことで触媒作用に関与している。 PHMは還元剤としてアスコルビン酸を用い、水酸化の段階でO2の酸素原子1個をペプチドに取り込む。 このようにPHMは、ドーパミンをノルエピネフリンに変換するドーパミンβモノオキシゲナーゼ（DBM）と酵素的に非常によく似ている（Chap.12参照）。 このα-アミド化反応の第二段階は、PAMの第二酵素ドメインであるペプチジル-α-ヒドロキシグリシンα-アミド化リアーゼ（PAL）により行われる。 PALドメインは、新規の二価金属イオン依存性酵素を構成している。 神経細胞では、主に膜貫通型のPAMタンパク質が発現しているが（図18-5）、一部の内分泌細胞では、mRNAスプライシングにより、膜貫通型ドメインを欠いた可溶型のタンパク質が発現するようになっている。 PAMの膜貫通型では、COOH末端の短いドメインが細胞質まで伸び、LDCVと細胞表面の間でPAMのルーティングに関与している。 LDCVの還元型アスコルビン酸の供給は、5つの膜貫通ドメインを持ち、細胞質のアスコルビン酸からLDCVの内腔のアスコルビン酸への電子移動に関わるチトクロムB561タンパク質によって維持されている。 シトクロムB561はカテコールアミン含有小胞にも存在し、DBMと同様の機能を果たしている（Chap.12参照）。 神経系や内分泌系の組織では、還元型アスコルビン酸の濃度が血中濃度の約 100 倍に維持されているが、他のほとんどの組織ではアスコルビン酸が濃縮されていない。
いくつかのペプチドはNH2-末端のピログルタミン酸残基、また環状グルタミン酸（<Glu）とも呼ばれ、例えばチロトロピン放出ホルモン（TRH）およびゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）のように生物活性に必須であるものを有している。 この段階を担う酵素がグルタミニルシクラーゼであり、元のNH2-末端のGlnを<Gluに変換している。 グルタミニルシクラーゼの制御と機能については、まだ広く研究されていない。 ペプチドのもう一つの重要な修飾はα-N-アセチル化である（図18-6と図18-7）。 POMCの過程でα-N-アセチル化はACTH(1-13)NH2の肌を黒くする作用を大きくする一方で、ACTHの副腎ステロイド生成能とβ-エンドルフィンのアヘン活性を消失させる。 この修飾を行う酵素はまだ精製もクローニングもされていません。
Figure 18-7
ペプチドを大きなコア小胞に細胞特異的にパッケージすると、非常に異なったパターンのペプチド分泌を引き起こすことがあります。 神経ペプチドの明確な成熟分泌顆粒（MSG）への仕分けはバッグセルニューロンで示されるが、内分泌系では起こらない（詳細）
例として、図18-6はPOMC系における処理ステップのパターンを示している 。 最初の内タンパク質分解ステップ（図18-6、ステップ1〜4）はPC1によって媒介され、すべてのPOMC産生ニューロンおよび内分泌細胞において、通常は示された数値順で生じる。 ステップ1と2はトランスゴルジネットワークで開始され、LDCVで継続し、ステップ4はLDCVでのみ発生することが明らかである。 ステップ5-7はLDCVでのみ起こり、PC2が必要と思われる。 成体の下垂体前葉では、副腎皮質細胞はPC1を含むがPC2は含まず、1-4の切断のみを実行する。 しかし、生後発達の初期には、副腎皮質刺激ホルモンもPC2を発現し、5-7開裂が副腎皮質刺激ホルモンで一過性に見られる。 ラットでは生後数週間でPC2の発現とACTH内の開裂（5開裂）が同時に減少するが、これは副腎ステロイド生成に対するACTH制御の成熟パターンが出現する頃である
POMCを作るメラノトロピーとCNSニューロンはPC1とPC2の両方を発現し、したがってこれらの細胞では小さいペプチド生成物が見られる。 PAMはすべてのPOMC産生細胞で発現しているため，生物学的機能が明確でない小さなペプチドである結合ペプチド（JP）のα-アミド化がすべてのPOMC細胞で急速に起こります（図18-6）． 下垂体中葉のメラノトロピーと孤束核のPOMCニューロンでは、ACTH(1-13)NH2およびβ-エンドルフィンのα-N-アセチル化が起こる。 メラノトロピーでは、ACTHのα-N-アセチル化が切断前に起こりうる5。 図18-4に示すように、行われる特定の切断、およびペプチド生成物のNH2-およびCOOH-末端への修飾は、放出される生物活性ペプチドの混合物を決定する
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