羊水と羊膜の幹細胞: マーカー探索

Abstract

羊水（AF）と羊膜（AM）は近年、幹細胞や前駆細胞の有望な供給源として特徴づけられるようになった。 両者とも間葉系幹細胞のような成体幹細胞に類似した特徴を持つ亜集団を含むだけでなく，(i)多能性マーカーの発現，(ii)試験管内での高い増殖，(iii)多系統分化能といった胚性幹細胞の特徴をも示す。 近年、これらの幹細胞の単離と詳細な特性解析に注目が集まっている。 しかし、これらの幹細胞の表現型にはばらつきがあり、異なるグループによって表現される不均一性や、これらの細胞でのみ発現する単一のマーカーが存在しないことが、これらのソースから純粋で均質な幹細胞集団を分離することや、これらの細胞を治療用途に使用する可能性を妨げている可能性があります。 本稿では、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、セクレトーム解析に基づく新しい方法論を用いて、AFやAMなどの胎児由来の幹細胞に対するマーカー探索の最近の進展をまとめることを目的とする

1. はじめに

羊水（AF）および羊膜（AM）は、将来的に臨床治療への応用が可能な幹細胞の豊富な供給源である。 ヒト胚性幹細胞（ESC）研究とは異なり、これらの幹細胞の分離に関する倫理的な懸念は最小限に抑えられている。 AFは出生前診断のために妊娠15週から19週の間に予定されている羊水検査で採取され、余分なサンプルは細胞採取に使用することができるが、AMは通常、定期妊娠の帝王切開の際に採取される。 これらの幹細胞集団は不均一であるため、特定のタイプの細胞を分離することは難しく、それぞれの細胞の詳細な表現型と分子的な特徴を明らかにする必要があります。 オミックスアプローチを含む研究は、これらの細胞の分子発現のメカニズムをよりよく理解し、治療アプローチに使用する前に、これらの細胞を分離するための正しい方法論を定義するための基本的なものです。

この論文の目的は、胎児とAM由来の幹細胞の主な生物学的および分子的特性を示すとともに、転写ゲノム、プロテオミクス、またはセクレタムの分析などのグローバルな方法論を使用してマーカー探索における最近の進歩にも焦点を当てることにあります。 羊水

AF は発達中の胚の保護液として機能し、胚発生中に機械的支持と必要な栄養素を提供する。 羊水穿刺は、何十年も前から胎児の核型分析および出生前診断のルーチンの手順として用いられ、様々な遺伝病の検出を可能にしている。

羊水の主成分は水であるが、その全体組成は妊娠中を通して変化する。 妊娠初期には、羊水の浸透圧は胎児血漿とほぼ同じである。 胎児皮膚の角化後は、羊水の浸透圧は母体血漿や胎児血漿に比べて低下するが、これは主に胎児尿の流入によるものである 。 さらに興味深いことに、羊膜は胎児またはその周囲の羊膜に由来する幹細胞集団の豊富な供給源でもある . 最近、羊膜由来細胞の細胞特性や、前臨床モデルや移植治療への応用の可能性について、いくつかのグループによる追加的な研究が行われている

1.1.1. 羊水幹細胞（AfSCs）

羊水細胞（AFC）は、3つの生殖層に由来する異種集団である。 これらの細胞は上皮起源を共有し、発達中の胚または羊膜の内表面のいずれかに由来し、羊膜幹細胞として特徴づけられる 。 AFCは主に3つのグループの付着細胞からなり、その形態的、増殖的、生化学的特徴に基づいて分類される . 上皮細胞（Eタイプ）は胎児の皮膚や尿に由来する立方体から円柱状の細胞、羊水細胞（AFタイプ）は胎児膜に由来する細胞、線維芽細胞（Fタイプ）は主に線維性結合組織から生成される細胞である。 AF型とF型は共に線維芽細胞の形態を持ち、支配的な細胞型はAF型と思われ、ケラチンとビメンチンを共発現している . いくつかの研究により、自然流産率が0.06-0.5%である羊水検査を行う際に採取される少量の第2期羊水から、ヒト羊水幹細胞（AFSCs）を容易に得ることができることが報告されている。 現在までに、多くの異なる培養プロトコルが報告され、幹細胞集団の濃縮に成功している。 AFSCの分離とそれぞれの培養プロトコルは、Klemmtらによる最近のレビューで要約され、以下のように分類される。 (i) 最初のコロニーが出現するまで7日以上初代培養物を放置する一段階培養プロトコル、 (ii) 5日間培養しても接着しない羊膜細胞を回収してさらに拡大する二段階培養プロトコル、 (iii) CD117 (c-kit receptor) の細胞表面マーカー選択、 (iv) 初期培養で形成した間葉系前駆細胞コロニーの機械的分離、 (v) 短期培養による線維芽細胞コロニー分離 、などである。 これらの方法論に従って単離されたAFSCの大部分は、多能性間葉系表現型を共有し、成体MSCと比較して高い増殖能と広い分化能を示した

1.2. 羊膜（AM）

血管組織を持たない羊膜は、胎児膜の内層の大部分を形成し、3層から構成されている。 (i) 上皮細胞からなる上皮単層、(ii) アセルラー中間基底層、(iii) 間葉系幹細胞に富む外側の間葉系細胞層で、絨毛に近接した位置に配置されている 。 AMは、火傷の創傷治癒、上皮形成の促進、感染防御のために、何十年にもわたって臨床で使用されてきた。 最近では、口腔粘膜の外科的欠損、眼球表面の再建、角膜穿孔、膀胱の増強などの創傷被覆材として、AMの使用が評価されています。 羊膜幹細胞（AMSC）

羊膜幹細胞には、羊膜上皮層と羊膜間葉系層に由来する羊膜上皮細胞（AECs）と羊膜間葉系幹細胞（AM-MSCs）の2種類があり、AMSCは羊膜上皮細胞と羊膜間葉系細胞に由来する。 どちらの細胞も、発育中の胚の前駆段階で、三大原始生殖層の境界が形成される前に発生し、そのほとんどが上皮性である . AECsとAM-MSCsの分離には様々なプロトコルが確立されており、主にAMを絨毛膜から機械的に分離し、その後酵素で消化することに基づいている . AM-MSCsは可塑的な接着と線維芽細胞の形態を示し、一方AECsは玉石上皮の表現型を示しました。 AM-MSCsは成体由来のものと同様の表現型特性を有していた。 さらに興味深いことに、AM-MSCsはAF-MSCsと同様に、成人由来のMSCsと比較して高い増殖率を示し、3つの生殖層に由来する細胞への多分化能を有していた

2. 羊水幹細胞

羊水は最近、幹細胞由来の様々な細胞の代替的な胎児源として浮上してきた 。 ここでは、羊水幹細胞を特徴付ける重要なマーカーをまとめることを目的とする。 現在までのところ、MSCは心房細動の最も特徴的な部分集団である。 AF-MSCsは、フローサイトメトリー解析により、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166、CD49e、CD58、CD44といった典型的な間葉系マーカーの発現を示していた。 さらに、これらの細胞はHLA-ABC抗原を発現していたが、造血マーカーCD34とCD45、内皮マーカーCD31、HLA-DR抗原の発現は検出されなかった . さらに重要なことは、培養したAF-MSCの大部分が、八量体結合タンパク質3/4 (Oct-3/4), ホームボックス転写因子Nanog (Nanog), および段階特異的胚性抗原4 (SSEA-4) などの多能性マーカーを発現していたことである .

また羊水細胞培養にはCD117 (ESC や始原胚細胞に主に存在する幹細胞因子特有のチロシンキナーゼ) プラス細胞の小さな集団があり、培養中にクローン増殖できることが報告された .さらに羊水細胞は、CD117プラス細胞 (主に始原胚細胞 (ESCs、FGF) と呼ばれる、幹細胞因子に特異的なチロースキナーゼ) を含んでいる。 CD117+ AFSの分化特性が初めてin vivoでテストされ、この方法で幹細胞であることが証明された。 AFSCsは紡錘形の線維芽細胞に由来することが実験的に示唆されていた。

AFSCsの亜集団を解析する試みとして、我々のグループは最近、増殖および分化特性が異なる間葉系由来の2つの形態的に異なる集団、紡錘形（SS）と丸形（RS）と呼ばれるAFSsを同定した。 両集団とも間葉系幹細胞マーカーを同程度に発現していた。 しかし、SSコロニーはRSコロニーに比べ、CD90およびCD44抗原をより高レベルで発現していることが確認された

2.2. 羊膜幹細胞（AMSCs）

AMSCsの詳細な免疫表現型解析により、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD54、CD73、CD90、CD105、 , CD166、.などの抗原が発現していることが判明した。 Stromal stem cell marker 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, collagen I and III (Col1/Col3), α-smooth muscle actin (α-SMA), CD44, vimentin (Vim), fibroblast surface protein (FSP), HLA-ABC antigen.など。 しかし、細胞間接着分子1（ICAM-1）の発現は非常に低く、TRA-1-60、血管細胞接着タンパク質1（VCAM-1）、フォンウィルブランド因子（vWF）、血小板内皮細胞接着分子（PECAM-1）、CD3およびHLA-DRは検出されなかった . AM由来の細胞で最も多く検出されるタンパク質の一つがラミニンで、分化、細胞の形や移動、組織再生に重要な役割を担っている。 さらにRT-PCR解析により、AMSCsは高経過期においても、Oct-3/4、zinc finger protein 42（zfp42またはRex-1）、幹細胞因子タンパク質（SCF）、神経細胞接着分子（NCAM）、ネスチン（NES）、骨形成タンパク質4（BMP-4）、GATA結合タンパク質4（GATA-4）、肝細胞核因子4α（HNF-4α）といった遺伝子を発現することが示された。 ブラキリー、線維芽細胞増殖因子5（FGF5）、paired box protein（Pax-6）、骨形成タンパク質2（BMP2）の転写物は検出されなかった。 同様に、AECはFACS分析により、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD105、CD117、CD166、Stro-1、HLA-ABCに対して陽性で、CD14、CD34、CD45、CD49d、HLA-DRに対しては陰性であった … さらに、AECはSSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, sex determining region Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 and Tra1-80, fibroblast growth factor 4 (FGF4), Rex-1, cryptic protein (CFC-1), and prominin 1 (PROM-1) などの幹細胞マーカーを発現していたことが明らかになった

3. Transcriptomics

3.1. 羊水幹細胞

骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、羊水幹細胞と比較した羊水幹細胞の遺伝子発現シグナルの機能解析は、当初Tsaiらによって行われた。 この3つの供給源から得られたMSCsに発現する遺伝子は、（i）細胞外マトリックスの再構築（CD44、コラーゲンII（COL2）、インスリン様成長因子2（IGF2））に関するグループに分類することができる。 およびTIMP1）、（ii）細胞骨格制御（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（PLAU）および受容体（PLAUR））、（iii）ケモカイン制御および接着（αアクチニン1（ACTN1））、（iv）細胞接着（TIMP1（TIMP1））、（v）細胞骨格制御（PLAUR（PLAUR））、（v）組織接着（ACTN1）、（v）組織接着（TIMP1（VI）））。 アクチン関連タンパク質複合体サブユニット1B（ARPC1B）およびトロンボスポンジン1（THBS1））、（iv）プラスミンの活性化（組織因子経路阻害剤2（TFPI2））、が挙げられる。 (v）トランスフォーミング成長因子β（TGFβ）受容体シグナル（カベオリン1（Cav1）、カベオリン2（Cav2）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1A（CDKN1A））、（vi）E3ユビキチンリガース（SMURF）コード化遺伝子。 BM-、CB-、AM-MSCsと比較してAF-MSCsで発現が増加した遺伝子には、オキシトシン受容体（OXTR）のような子宮成熟や収縮に関わる分子、ホスホリパーゼA2（PLA2G10）などプロスタグランジン合成の調節に関わる遺伝子が含まれていた。 このグループの他の発現上昇遺伝子は、（i）トロンビントリガー反応（（F2RとF2RL））、（ii）ヘッジホッグシグナル（（ヘッジホッグアシルトランスフェラーゼ（HHAT））、（iii）Gタンパク質関連経路（RHO関連GTP結合タンパク質（RHOF）、Gタンパク質シグナル5と7のレギュレータ（RGS5、RGS7）、ホスホリパーゼCベータ4（PLCB4））に関するシグナル伝達に関わっていた… ….

最近のAFSCsの研究では、Kimらが初めてillumina microarray解析により、異なる継代中の全AFSC集団の遺伝子発現変化を報告した。 1970個の異なる発現遺伝子が検出され、その発現プロファイルに従って9つの異なるクラスターに分類された。 発現量が徐々に増加する遺伝子としては、ケモカイン（C-X-Cモチーフ）リガンド12（CXCL12）、カドヘリン6（CDH6）、葉酸受容体3（FOLR3）などが挙げられた。 低下した遺伝子は、サイクリンD2（CCND2）、ケラチン8（K8）、IGF2、ナトリウム利尿ペプチド前駆体（BNP）B、細胞性レチノイン酸結合タンパク質2（CRABPII）であった。 さらに、老化遺伝子に関するチップデータ解析を行ったところ、神経成長因子β（NGFβ）、インスリン受容体基質2（IRS-2）、インスリン様成長因子結合タンパク質3（IGFBP-3）、アポリポ蛋白質E（APOE）などの遺伝子転写物のアップレギュレーションが確認された。 PLAU、E2F転写因子1（E2F1）、IGF2、乳がん1型感受性遺伝子（BRCA1）、DNAトポイソメラーゼ2α（TOP2A）、増殖細胞核抗原（PCNA）等の遺伝子の発現量。 フォークヘッドボックスM1（FOXM1）、サイクリンA2遺伝子（CCNA2）、budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta（BUB1B）、サイクリン依存性キナーゼ1（CDC2）は、培養中に徐々にダウンレギュレートされていました。

Wolfrumらは、AFSCをAF由来のiPSC（AFiPSC）およびESCsと比較し、グローバルな遺伝子発現解析を行った。 その中で、自己再生や多能性に関わる遺伝子（1299遺伝子 例：POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, microRNA-binding protein LIN28）、AFSCs特異性（665遺伝子例：, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatosis type 2 (NF2), protectin (CD59), tumor necrosis factor superfamily member 10 (TNFSF10), 5′-nucleotidase (NT5E)) が AFSCs で検出された． さらに著者らは、AFSC培養で観察される老化を回避するリプログラミングの効果を調べるために、初期および後期継代のAFSCsにおける老化およびテロメア関連遺伝子の発現を調べた。 AFiPSC株と比較してAFSCで発現が異なる64遺伝子が同定された。 このうち、テロメア関連遺伝子や細胞周期の制御に関わる遺伝子、例えば、mitotic arrest deficient-like 2 (MAD2L2), poly ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), replication protein A3 (RPA3), dyskeratosis congenita 1 (DKC1), mutS homolog 6 (MSH6), checkpoint homolog (CHEK1), the polo-like kinase 1 (PLK1), and the polo-like kitase 1 (PRO1)があげられる。 POU class 2 homeobox 1 (POU2F1), CDC2, Bloom syndrome gene RecQ helicase-like (BLM), Werner syndrome RecQ helicase-like (WRN), DNA methyltransferase 1 (DNMT1), DNA methyltransferase 3 beta (DNMT3B), lamin B1 (LMNB1) and the DNA replication factor 1 (CDT1) は AFiPSCs および ESCs と比べ減少していることが示されました。 一方、ペプチジルプロリルcis/trans isomerase (PIN1), lamin A/C (LMNA), growth arrest and DNA damage inducible alpha (GADD45A), chromobox homolog 6 (CBX6), NADPH oxidase 4 (NOX4), endoglin (ENG), ヒストンH2Bタイプ2-E（HIST2H2BE）、CDKN1A、CDKN2A成長分化因子15（GDF15）、セリンプロテアーゼ阻害剤1（SERPINE1）などが、AFiPSCsおよびESCsと比較して、AFSCsで発現が増加しました。

3.2. 羊膜幹細胞

AM-MSCsについては、DNAマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析が報告されている 。 これらの実験データは、AF、CB、BM-MSCsの遺伝子発現プロファイルと比較したAM-MSC遺伝子発現パターンに関する情報を提供した。 AM-MSCsでは、母胎と胎盤の間の免疫適応制御に関与するいくつかの発現上昇遺伝子が同定された。 中でも、スポンディン2（SPON2）、インターフェロンα誘導性タンパク質27（IFI27）、ブラジキニン受容体B1（BDKRB1）、小型誘導性サイトカインサブファミリーBメンバー5および6（SCYB5、SCYB6）、山口肉腫ウイルス関連癌遺伝子ホモログ（LYN）は発現が増加していた ……。 また、AF、CB、BM-MSCと比較してAM-MSCで発現が増加していたその他の遺伝子としては、(i)フォークヘッドボックスF1 (FOXF1), heart and neural crest derivatives expressed 2 (HAND2), 転写因子21 (TCF21) といった転写因子、(ii) ジペプチド化酵素6 (DPP6), トリプトファン 2,3 ジオキシゲナーゼ (TDO2), シアリル転移酵素 (STs) などといった代謝酵素が含まれていた.

4. プロテオミクス

4.1. 羊水幹細胞

上皮細胞（E型）、羊水特異的細胞（AF型）、線維芽細胞（F型）を含む全幹細胞集団のプロテオミクス研究により、2400のスポット、432種の遺伝子産物が同定された。 タンパク質の大部分は細胞質（33%）、ミトコンドリア（16%）、核（15%）に局在し、主に酵素（174種類）と構造タンパク質（75種類）であった。 また、膜および膜関連タンパク質も比較的高い割合で含まれていた（7%）。 検出されたタンパク質のうち、上皮細胞に対応するものは、ATP synthase D chain (ATP5H), NADH-ubiquinone oxidoreductase 30 kDa subunit (NUIM), annexin II (Anx2), annexin IV (Anx4), 40S ribosomal protein SA (Rpsa), glutathione S-transferase P (GSTP), など9種類であった。 major vault protein、サイトケラチン19および7（CK-19、CK-7）などが、線維芽細胞ではフィブロネクチン、トロポミオシン、トランスジェリン（TAGLN）、arp2/3 complex 34 kDa subunit（P34-arp）、ゲルソリン（Gsn）、伸長因子1-β (EF-1β) など12のタンパク質が発現すると報告されている。 ケラチン、リボヌクレオプロテイン、Anx2、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ（ACAT1）など、ケラチノサイトに発現しているタンパク質は8種類、トロポミオシン、ケラチンなど表皮に発現しているものは3種類、間葉系細胞（ヴィメンティン1（Vim1））に1種類存在することがわかった。

最近の研究では、羊膜細胞における代謝酵素の発現の多様性が代謝症候群や遺伝的症候群に関与していることを示す証拠が得られ、その検出が出生前診断に重要である可能性が示された。 AFSCに存在する特定の代謝酵素を決定するためのより詳細な解析がOhらによって報告された。 その結果、糖質処理酵素、アミノ酸処理酵素、プリン代謝タンパク質、中間体代謝酵素など99のタンパク質が同定された

CD117+ AFSCsの異なる培養継代に対してプロテオーム解析も行われ、主に初期の継代で発生するタンパク質発現の変動が見られた . 初期培養と後期培養では23のタンパク質が発現変動し、最も発現が低下したタンパク質は、Col1、Col2、vinculin（Vcl）、CRABP II、stathmin（STMN1）、cofilin-1（CFL1）であった。 一方、TAGLNとCol3は、経時的に増加している。 また、26Sプロテアーゼ調節サブユニット7（PSMD7）、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素アイソザイムL1（UCH-L1）、不均一核リボ核タンパク質H（hnRNP H）、TAR DNA結合タンパク質43（TDP-43）などが、継代の過程でレベルの異常が見られるタンパク質であることがわかった。

2007年に、ヒトAF-MSCsのプロテオミクスマップを構築し、BM-MSCs由来のものと直接比較しました。 261種類のタンパク質がAF-MSCsで同定され、その大部分は細胞質（41%）に局在し、その他は小胞体（8%）、核（13%）、ミトコンドリア（12%）、リボソーム（1%）、細胞骨格（6%）、細胞質および核（5%）、分泌タンパク質（2%）で認められた。 AF-MSCsは、細胞周期の進行や細胞増殖を制御することが知られているubiquilin-1（UBQLN1）、核球増殖制御タンパク質である増殖関連タンパク質2G4（PA2G4）など、増殖や細胞維持に関わるタンパク質を多数発現していた。 胚発生時に制御され、細胞周期や細胞接着の制御に関与する分泌タンパク質acidic and rich in cysteine (SPARC) や、同じく細胞周期を制御する enhancer of rudimentary homolog (ERH) などがあります。 また、幹細胞に存在し、分化に関連するTAGLNとガレクチン1（Gal 1）もAF-MSCsに多く発現していることが示された。 その他、Deltex-3-like (DTX3L) などの発生に関わるタンパク質、CFL1、coactosin-like protein (CLP)、 enabled protein homolog (Enah) などの細胞骨格形成や移動に関わるタンパク質が高発現していることが示された。 予想通り、VimもAF-MSCsで多量に発現していた。 本研究では、AF細胞とAF-MSCsに共通して同定されたタンパク質の詳細な比較も行った。

その後の研究で、我々は形態的に異なる2種類のAF間葉系前駆細胞（SSとRS）の2DEによるプロテオームマップを確立した。 その結果、25のタンパク質が2つの細胞集団で異なって発現していた。 RS-AF-MSCsと比較してSS-AF-MSCsで発現が増加したタンパク質は、レチクロカルビン3前駆体（RCN3）、コラーゲンα1（I）（COL1α1）、FK506結合タンパク質9前駆体（FKBP9）、Rho GDP-dissociation inhibitor 1（RhoGDI）、塩素細胞内チャネルタンパク質4（CLIC4）、トリプトファニルtRNA合成酵素（TrpRS）および70kD熱ショックタンパク質（HSP70）であった。 RS-AFMPCsではPeroxiredoxin 2 (Prdx2), 60 kD heat shock protein (HSP60), GSTP, Anx4が発現上昇した。 しかし、RS-AF-MSCsで同定されたタンパク質は、サイトケラチン-8、-18、-19 (CK-8, -18, and CK-19), カテプシンB (CTSB), CLP, integrin αV protein (CD51) のみであった。 Vim, Gal, Gsn, prohibitin (PHB) などの間葉系関連タンパク質は、両集団で同レベルで発現していた

4.2. 羊膜幹細胞

ヒトAMタンパク質を研究するための詳細なアプローチは、Hopkinsonらによって記述されている。 この研究では、著者らはヒト移植用に調製された羊膜サンプルのプロテオーム解析を2-DEゲルを用いて行った。 また、AMサンプルの洗浄液も調べ、分泌されたタンパク質を同定した。 AMと洗浄液の両方から検出されたタンパク質は、タンパク質の部分的な放出が起こったことを示唆した。 これらのタンパク質は、ほとんどが可溶性の細胞質タンパク質であり、細胞内局在と機能によって分類された。 AMに最も多く含まれ、一貫性のあるタンパク質の一例として、創傷修復、炎症反応、血管新生に関与することが報告されているTHBS1が挙げられる。 ミメカン（オステオグライシン/OGNとも呼ばれる）は、結合組織のECMに見られる小さなロイシンに富んだプロテオグリカンで、AMに検出されるもう一つのタンパク質である。 ミメカンは、組織の引張強度と水和性を維持することが報告されている。 さらに、ミメカンの大きな形はAM細胞に発現しており、タンパク質分解を受けやすいことがわかった AM細胞には、細胞分化や創傷治癒の際に膜関連成長因子として働くECM接着分子であるTGF-β誘導タンパク質ig-h3（βIG-H3）と、α6β4インテグリンの構成要素であるインターグリンα6（CD49f）もかなりの量存在した . α6β4-IG-H3 相互作用は、細胞接着や創傷修復のシグナル伝達経路の仲介に重要な役割を果たすことがよく知られています

Baharvandらによるもうひとつの重要な研究は、上皮で剥がれたヒトAMの分析に焦点を当て、非処理AMと比較して定量的にも定性的にも違いがあることを示しています . 彼らは、眼表面再建治療のための辺縁幹細胞ニッチとして使用されているヒトAM上皮のプロテオームを調査しました。 AMの2-DEゲルには515のスポットが検出され、MALDI TOF/TOF MSを用いて43のタンパク質が同定された。 最も豊富なタンパク質は、プロテオグリカン（PG）ファミリーのメンバーであるルミカン（LUM）とOGNの異なるアイソフォームであった。 特にOGNは、細胞増殖、血管新生、炎症など、多くの生物学的プロセスに関与している可能性がある。 その他のタンパク質としては、コラーゲン VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), フィブリノーゲンβ鎖 (FGB), トランスグルタミナーゼ 2アイソフォームA (TGM2A), b-actin variant (ACTB), 70 kD heat shock protein 5 (HSPA5), nidogen 2 (NID2), CD49f, βIG-H3, 管状間質性神経炎 (TIN) が検出された。 また、本研究で同定されたタンパク質の中には、細胞外マトリックス（ECM）に関連するものがあった。 検出されたもののうち、フィブロネクチン（FN）、ラミニン、コラーゲンIV（Col4）およびVIIは上皮の接着や移動を促進することが報告された.

5. セクレトーム

最近、AFSCからの分泌タンパク質の分析に関して大きな進展があった。 AFSCの分泌物が血管新生を促進し、マウスのレシピエントで強い血管新生反応を引き起こすことができることが報告されている 。 この研究によると、LuminexのMAPテクノロジーを用いて、AFSC調整培地を詳細に分析した結果、既知の血管新生促進因子と血管新生抑制因子が存在することが明らかにされた。 分泌タンパク質として、血管内皮増殖因子（VEGF）、間質細胞由来因子1（SDF-1）、インターロイキン8（IL-8）、単球走化性タンパク質1（MCP-1）、2つの血管新生阻害因子、インターフェロンγ（IFNγ）およびインターフェロンγ誘導タンパク質10（IP-10）などが同定された …………………………………………………………………… また、比較的少数のAFSCが、検出可能な量の血管新生成長因子やサイトカインを分泌することが明らかになった。 8908>

AFSCから分泌されるタンパク質の系統的な研究により、AFSCからの血管新生可溶性因子が虚血ラットモデルにおける内皮前駆細胞の動員を仲介することができるという結論に至った . 特に、AFSCsから得られた調整培地は、虚血ラットの皮膚フラップに血管新生成長因子やサイトカインを局所的に送達し、内皮前駆細胞を動員することで内因性修復の引き金になることがわかった。 その結果、AF-MSCの調整液には様々なサイトカインや成長因子が検出された。 インターロイキン10 (IL-10), インターロイキン27 (IL-27), インターロイキン17ファミリー (IL-17E), インターロイキン12p70 (IL-12p70), インターロイキン1β (IL-1β), インターロイキン1受容体アンタゴニスト (IL-1ra) など、炎症性サイトカインの局所および全身でのダウンレギュレーションを誘導するサイトカインが検出された。 また、組織修復を促進するSERPINE1、MCP-1、SDF-1も分泌された。 興味深いことに、高発現した成長因子の中には、血小板由来内皮細胞成長因子（PD-ECGF）、エンドスタチン／コラーゲンXVII（EN／Col17）、尿中プラスミノーゲン活性化因子（uPA）、TIMP1、TIMP2、ヘパリン結合EGF様成長因子（HB-EGF）、繊維芽細胞成長因子7（FGF7）、上皮成長因子（EGF）、肝再生・組織修復に関わるものがありました … 続きを読む

6.まとめ

これまでのデータから、羊水と羊膜は間葉系幹細胞の有望な供給源である可能性が示唆された。 実際、MSCはより豊富であり、その単離のための幅広いプロトコルが記載されている。 しかし、同じ種類の細胞でも培養条件が異なると遺伝子発現パターンが異なることが報告されており、in vitroでの単離・増殖に限界がある。 フローサイトメトリーや免疫組織化学などの表現型解析、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、セクレトーム解析などのアプローチにより、これらの細胞のタンパク質プロファイルを明らかにすることを目的としている（図1）。 これらの研究によって得られるデータは、幹細胞の分化レパートリーを明らかにし、幹細胞の分子プロファイルを検証することが期待される。 しかしながら、これらの多能性細胞の機能解明のための系統的研究を促進する均質な集団の単離が大きな課題となっています。

このようなアプローチにより、これらの細胞の表現型を映し出す重要な抗原が同定され、その特徴的な特性を説明できるようになるかもしれません。 8908>

付録

Further Investigation

AFSCs または AMSCs の適切な分離方法および培養条件は、一貫した表現型の同定を可能にするものでしょうか。

AFSCやAMSCの分離に使用できる単一のマーカーはありますか？

AFSCやAMSC集団は不均一で、その表現型や分子特性は異なっています。 8908>

AFSCs or AMSCsは、再生医療におけるツールとして、最小限の動物性物質を用いた培養条件の確立に利用することができる。

Marker Discovery
AFSCs and the AMSCs initial characterization is by immunophenotype analysis using well characterized cell surface markers such as AFSCs: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSCs: CD13、CD29、CD44、CD49e、CD73、CD90、CD105、CD117、CD166、Stro-1、HLA-ABC、SSEA-3、SSEA-4、Nanog、Sox2、Tra1-60、Tra1-80、FGF-4、CFC-1、PROM1

トランススクリプトミックおよびプロトミクスにより、
AFSCsなどの発現するキーマーカーを特定することを明らかにした。 Nanog、Sox2、POU5F1、NF2、IGF2、PLAU、OXTR、HHAT、RCS5、CDC2、COL2、TAGLN、Gsn、Anx4、GSTP、CK-19、Vim、Col1、Gal、AMSCs: AFSCとAMSCに共通するマーカーがないため、より幅広いマーカーを採用する必要がある。 このことはまた、AFSCとAMSCの特徴付けに最も適したマーカーを定義するために、さらなる詳細なアレイと機能解析の実施を促している。