要旨
はじめに. 整形外科領域では、より大きな欠損に骨形成材を使用することが必須である。 自家移植と同種移植が知られており、自家移植が最良の選択であると考えられている。 しかし、自家移植には侵襲的な処置が必要であり、脆弱な患者には困難であり、骨採取後に局所的な副作用を引き起こす可能性があります。 また、自家骨移植と同種骨移植の違いは、患者さんの臨床結果に大きく影響するため、同種骨移植の利用が増加しています。 方法 正常ラット12匹、骨粗鬆症（OP）誘発ラット12匹の計24匹の雌ノルウェーブラウンラットを対象とした。 OPの誘発は、卵巣摘出（OVX）後90日の骨体積率（BV/TV）によりin vivoで確認された。 各ラットの一次手術は、脛骨近位部に両側とも1mmの穴をあけるものであった。 自家移植と同種移植が左右の脛骨に無作為に割り当てられた。 21日間観察した後、ラットは犠牲になった。 脛骨サンプルを採取し、骨誘導とマイクロアーキテクチャーの特性についてマイクロCTスキャンを行い、組織学的検査のために包埋した。 結果 OP誘導はOVXの3ヶ月後に海綿骨BV/TVが正常骨と比較して68.5%減少することで確認された。 マイクロアーキテクチャー解析および組織学的解析により、3週間後の正常骨または骨粗鬆症骨における自家移植と同種移植の骨形成能に有意差は認められなかった。 結論 本研究では、21日後の正常または骨粗鬆症のラット脛骨欠損モデルにおいて、自家移植と同種移植の間に差は認められず、同種移植が自家移植に代わる良い代替物であることが示唆された＜6666＞＜7117＞1. はじめに
骨の損失や欠損は、外傷、感染症、または人工関節置換術の後に引き起こされることがあります。 これらは、整形外科における最大の臨床的課題の1つに分類される。 インプラント手術は一般的な用語であり、整形外科、脳神経外科、口腔、顎顔面専門医による骨欠損の修復などの介入手術の大部分を含みます。 これらの手術は、年間200万回以上行われると推定され、患者や経済的な結果に大きな影響を与えます。 しかし、自家骨を採取するためには侵襲的な処置が必要であり、また採取できる量も十分ではありません。 腸骨稜から採取される自家骨移植は、自家腸骨稜骨移植（AICBG）と呼ばれています。 この方法は、出血、ドナー部位の痛み、感染症のリスク、および神経損傷などの病的状態を伴うことがあります。 自家骨移植手術の失敗率は、採取、取り扱い、移植方法の違い、患者の状態や骨の活力の違いにより、50%に上ることが示されている。 このような合併症や高コストのため、代替移植材として自家骨材料がしばしば使用されます。 自家骨は、他の患者から副作用なく簡便に採取できる。 しかし、この移植片材料は主に骨伝導効果を有し、疾患伝播、細菌感染、自己免疫宿主反応、移植片宿主非結合などの潜在的リスクを有している。 これらの副作用はより深刻ですが、しかし非常にまれです。 理論的には、最も優しい治療法は同種移植片です。 高齢者や脆弱な患者の増加に伴い、通常の骨構造と脆弱な骨構造の両方において、適切な欠損モデルで比較することによって知識を得ることが不可欠である。 生きた骨移植片を採取する必要性を減らすために、代用品があります。 そのアプローチは、動物および臨床モデルにおいて、異なる組織の幹細胞の使用から成長因子との組み合わせまで、多岐に渡っている。 骨粗鬆症は、加齢に伴い増加する疾患であり、人口の高齢化に関連した主要な公衆衛生問題であり、2030年には世界で20～30％の有病率と治療費が増加すると言われています。 骨粗鬆症は、骨密度の減少が顕著な骨の病気です。 これは、破骨細胞（OC）が骨芽細胞（OB）が生成できる以上の骨を吸収し、骨再形成ユニット（BMU）の安定性を乱し、骨吸収と骨形成のバランスが崩れ、最終的に骨量が減少することによって起こります。
これまでのところ、骨欠損修復における自家移植と同種移植の違いについての知識は限られている。 特に、術後、7日目、14日目、21日目の生体内縦断的なマイクロアーキテクチャの変化について。 評価は、すべての時点でマイクロCTスキャンを行い、21日目に安楽死させた後に組織形態学的評価を行った。 第一の目的は、自家移植と同種移植の間の骨形成を評価することであった。 副次的目的は、卵巣摘出から90日後の骨粗鬆症の誘発を確認することであった。 その結果、正常ラットと骨粗鬆症ラットの両方において、自家移植と同種移植の間で欠損修復に差がなかったことから、正常骨と脆弱骨の両方の欠損モデルにおいて、臨床的に自家移植の使用を減らし、追加の侵襲的採取処置の必要性を減らすことができると仮定された
2. 材料と方法
2.1. 動物モデル
24匹の雌のブラウンノルウェー近交系（BN/SSNOlaHsd）ラットが研究に含まれた。 正常ラット、骨粗鬆症ラットともに4ヶ月齢、平均体重gで、南デンマーク大学バイオメディカル研究所にて手術の2ヶ月前に収容し、馴化させた。 温度21-28℃、湿度40-60％、午前6時から午後6時の間点灯する制御された環境で、滅菌水と普通食またはCa欠乏食をそれぞれ自由に摂取することが可能であった。 ケージはおがくず製の床材と敷材を使用した。 動物たちは毎日、動物技師または研究者によって、行動の変化や不快の徴候がないか観察された。 動物の承認
すべての実験手順は、デンマークの動物研究ガイドラインに従って実施された。 この実験プロトコルは、デンマークの動物実験・検査局（No.2011/561-1959）により承認された。 本稿は「動物実験」に準じている。 Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE)ガイドラインに準拠しています。
2.3. 骨補填材
2.3.1. 自家骨移植材
自家骨移植材は、脛骨欠損手術のドリル工程で両側のラット脛骨から採取した。 骨は無菌的に処理され、チップは約0.5-1mmであった。 脛骨欠損の充填において、正常骨はドリル加工により十分な体積を有しており、隙間を充填することができた。 しかし、骨粗鬆症のラットでは、尾椎からの骨材で欠損部を追加充填する必要があった。 骨粗鬆症のラットでは、尾椎から骨材を追加で採取した。 尾の胴体への付着部から2mm遠位で小切開し、手術器具で軟組織を除去し、チップに切り分けた。 追加骨の必要性は、骨粗鬆症誘発後の骨密度の低下が顕著であったためである。 この方法は、ラットモデルにおける自家骨の採取法としてよく知られている。 Allograft
健康なノルウェー産褐色雌ラット1匹から作製した。 ガイドラインに従ってペントバルビタールで安楽死させ、大腿骨、脛骨、上腕骨の顆を無菌状態で採取した。 追加の軟部組織も注意深く除去した。 骨はボーンミル（Ossano Scandinavia ApS, Stockholm, Sweden）により調製した。 海綿骨構造を直径0.5-1 mmのチップに分割し、80℃で保存した。 使用前に、凍結した骨を30分間解凍し、外科的基準で欠損部に加えた。 これらの処置はすべて、南デンマーク大学バイオメディカル研究所の小動物手術室にて無菌状態で行われた
2.4. 研究デザイン
各脛骨に1つの対照群と1つの介入群を設けた、対の縦断研究デザインを使用した。 ノルウェー近交系（BN/SNOlaHsd）雌ラット計24匹を正常骨と骨粗鬆症骨で各12匹ずつ2群に分けた。 自家移植と同種移植は、左右の脛骨欠損において盲検化し、無作為に割り付け、さらに評価段階においても盲検化した（図1）。 脛骨手術の13週間前に、12匹のラットが骨粗鬆症誘発のために卵巣摘出術（OVX）を受けた。 脛骨近位部欠損の一次手術のため、同種移植片は使用30分前に解凍し、自家移植片は麻酔下で調製・採取した。 術後0日目、7日目、14日目、21日目に、マイクロCTスキャンを実施し、継続的に評価した。 犠牲時に、両側の脛骨近位部欠損サンプルを、組織学および組織形態測定のために採取した。 24匹のラットを含み、正常群または骨粗鬆症群に分けた。 12匹のラットがそれぞれ 各ラットは、左右の脛骨に自家移植と同種移植のグループを持ち、正常な骨と骨粗鬆症の骨の合計24個の試料を得た。 T1（0週目）：手術日、T2（0、1、2、3週目）：マイクロCTスキャン、T3：組織切片。
2.5. 外科的処置＜7758＞＜7921＞2.5.1. 卵巣摘出術（OVX）
ラットの背部を剃毛し、ヨウ素とエタノール（70%）で消毒した。 背部尾部に約1cmの鋭利な切開を加え、筋膜まで鈍的に剥離した。 腔内に侵入して卵巣をピンセットで採取し、卵巣の横で5.0エチロン縫合糸で結紮して摘出した。 創は2層で閉じた。 すべての手術は同じ日の同じ時間に、同じ場所で行われた。 術後、ラットはブプレノルフィン（Temgesic, RB Pharmaceuticals Limited, Berkshire, UK）、0.2 ml/100 g体重 s.c. で8時間間隔で、その後3日間鎮痛した。 卵巣摘出後、ラットは低カルシウムを含む特別食と水を自由摂取させた。 12週間後に骨粗鬆症の骨構造の誘導が確認され、脛骨一次欠損手術を開始することができた
2.5.2. 脛骨近位欠損
手術中の麻酔プロトコルは、OVX手術の方法論に従った。
両側の脛骨近位欠損は、標準の手術手順を使用してすべてのラットで行われた。 両肢を分離し、剃毛し、ヨードベット（Kruuse Vet、デンマーク）および70％エタノールで消毒した。 鋭い切開および鈍い探査は、脛骨近位部の内側を提示し、そこで、パイロット研究の結果に基づいて、反対側の皮質殻まで2.8mmおよび3mmの深さの円筒形欠損が作成された。 両脚から自家移植片を採取したため、まず移植片群の手術が行われた。 合計48個の円柱状の欠損を形成し、無作為化により予定された自家移植または同種移植で充填した。 創は、縫合糸4.0で2層に閉じられた。 術後、ラットは、ブプレノルフィン（Temgesic、RB Pharmaceuticals Limited、Berkshire、UK）、0.2ml/100g体重s.c.で4日間8時間間隔で鎮痛された。 マイクロCTスキャンおよびマイクロアーキテクチャ解析
両側の脛骨近位部を高解像度マイクロトモグラフィーシステム（vivaCT 40, Scanco Medical AG, Brüttisellen, Switzerland）でインビボスキャンした。
正常ラットおよび骨粗鬆症ラットの骨成長発達の評価のためのin vivoマイクロCTスキャンは、以下の4つの時点で行った：手術前日（0日目）、そして術後7、12、21日目。
さらに、骨粗鬆症誘導モデルを検証するために、3つの時点で経時評価を実施した。 (1）骨密度のベースラインを確立するためのOVX手術前（90日目）、（2）脛骨手術前（7日目）、（3）脛骨手術後（0日目）である。
インビボスキャンの間、ラットはクローズドボックスシステムで、1L/min酸素と4ml/minイソフルラン（IsoFlo vet, Abbott Laboratories Ltd, Berkshire, England）により6分間、ラットの反射に従って調節しながら麻酔をした。 完全鎮静後、ラットはプロトコールに従って酸素とイソフルランを連続供給したマスクで覆われた動物飼育ベッドに置かれた。 正確なスキャンのために関心領域は固定された。 画像は高解像度でスキャンされ、各欠損部位の代表的な評価のために500スライスでμm3（ピクセル）の3D再構成ボクセルサイズとなった。 このスキャンで指定されたパラメータは、骨粗鬆症の誘発と移植片の骨強化効果を確認するための海綿骨の微細構造特性であった。 骨量／組織量（BV/TV）、構造モデル指数、連結密度（CD）、海綿骨厚さ（TbTh）、海綿骨分離（Tb.Sp）、異方性の程度（DA）、骨表面密度、骨表面／体積比（BS/TV）、見かけ密度、材料密度などである。 組織学と組織形態学
手術の21日後、ラットはスキャンされ、動物認可プロトコルに従ってペントバルビタールの過量投与で犠牲になった。 移植材と骨を含む両側の脛骨近位部をホルムアルデヒド（4％）で固定し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に変更した。 脱水・脱灰後、固定し、パラフィン包埋した。 厚さ3〜4μm，剥離幅500μmで3枚連続切片化した． 3枚の切片はすべてヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した。
組織形態測定の関心領域（ROI）は、自家移植と同種移植の間で比較された元の脛骨欠損領域として特徴づけられた（図2）。 あらかじめ定義されたROI内では、体積分率は、オリンパスBX 51顕微鏡（デンマーク、Ballerup）で1セクションあたり300〜600ヒットで、点カウントのために検証されたステレオソフト（newCast Visiopharm、デンマーク）を使用してCavalieriの原理によって計算された。 骨の体積は、骨のヒット量を全ヒット量で割ったものとして計算され、パーセントで表示された
2.8. 統計解析
Two samples two-tailed -test and one-way ANOVA was used to compare possible differences between groups with GraphPad Prism v. 7 (GraphPad Software, Inc.). 5％未満の値を有意とみなした。
サンプルサイズは、各グラフトについて少なくとも10個の欠損を含んでいた。 我々は、脱落のリスクのために、各グループに12匹のラットを含めることを選択した。 検出力80％を選択したため、第一種の計算誤差は1.96/95％、第二種の計算誤差は0.84に設定された。 また、Minimal relevant differenceと標準偏差はともに70%に設定した。 動物観察
術後3週間の間に24匹のラットのうち、各群2匹ずつ計4匹が死亡した。 そのうち3匹はin vivo micro-CTスキャン中の麻酔への反応として死亡し、1匹は感染症が原因で死亡した。 残りのラットは研究に組み込まれた。 実験の観察期間中、動物は毎日、動物技師または研究者によって、不快な兆候や動物使用許可証の違反がないか観察された。 脛骨欠損手術後、いずれの群でも有意な体重変化は観察されなかった。 OVXを施したラットは最初の12週間でgからg（）へと体重が増加した。
3． 三次元マイクロアーキテクチャー特性
3.2.1. ラットにおける骨粗鬆症の誘発
OVX投与ラットは12週後、正常骨と比較して骨体積率、連結密度、骨表面密度、見かけ密度（）が低下していた。 構造モデル指数はtypical plateの-1.4からtypical rodの3.3まで上昇した。 骨梁の分離、異方性の程度、材料密度、骨表面積比は増加した（）。 海綿体の厚さは有意な変化を示さなかった（）（表1）。
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表1
3.2.2. 自家移植と同種移植によるマイクロアーキテクチャの変化
(1) 正常な骨におけるマイクロアーキテクチャの変化。 BV/TVは、0日目、7日目、14日目に自家移植に比べ、同種移植の欠損部で減少した（）。 しかし、21日目では、両群間に統計的な差は認められなかった（図3）。 マイクロCT画像の代表的な3D再構成を図4に表示した。
(a)
(b)
(a)
(b)
接続組織も同じ傾向で、0、7、14日目（）に値が減少したが、21日目には差がなかった。 海綿体の厚さは、移植群ではすべての時点で増加し（）、異方性の程度に差はなかった（図3）
(2) 骨粗鬆症骨におけるマイクロアーキテクチャの変化。 骨粗鬆症の骨のBV/TVは、0、7、14日目（）に同種移植群で骨の減少を示し、21日目以降も差がなかった（図4、5）
海綿体厚は0、14、21日目（）で自家移植群に有意差があったが7日目は差がない。 結合密度と異方性の程度はどの時点でも有意な差はなかった（図5）
3.3. 組織学および組織形態学
3.3.1. 組織学
すべての試料で欠損部に新しい骨形成が観察された。 移植片の残骸と新生骨の違いを区別することはできなかったが、欠損部内の総骨量はROI内の骨として算出された（図1、T3）
3.3.2. 組織形態計測
骨量は、正常骨と骨粗鬆症骨内では自家移植群と同種移植群の間に有意差は認められなかった。 正常骨の自家移植・同種移植と骨粗鬆症骨の自家移植・同種移植を比較すると、評価21日目の骨量は有意に減少していた（）＜6666＞＜5309＞正常骨の欠損部に移植物を含む新生骨の平均形成率は自家移植で53％、同種移植で51％であった。 骨粗鬆症の骨では、allograftが平均35%と最も骨量が多かったのに対し、autograftは33%であった（図6）。 また、欠損部における他の測定パラメータに有意差はなかった（）。
4.考察
本研究では、脛骨欠損ラットモデルにおいて、自己移植と同種移植の効果を比較し、正常骨と骨粗鬆症骨の最適な欠損修復を検討した。 仮説は、自家移植と同種移植のどちらを使っても、正常な骨でも骨粗鬆症の骨でも骨形成に差はないだろうというものであった。 マイクロCTや組織形態測定の結果、21日間の観察後、脛骨骨欠損に自家移植と同種移植を使用しても、正常な骨構造でも骨粗鬆症の骨構造でも有意差がないことがわかった。 しかし、マイクロCTスキャンでは、0日、7日、14日の時点で、allograft群では新生骨の量が減少していた。
研究がそれぞれの発明を比較するとき、autograftとallograftがゴールデンスタンダードとして機能すべきかどうか、意見が分かれるところである。 その違いは、主に学術的な意見と臨床的な意見、そしてどの種類の欠損を研究に使用するかということにあります。 特に、移植材の使用における課題とその限界を克服するために、代替材に注目が集まっているためです。
この研究の結果を評価する際、正常骨と骨粗鬆症骨の両方で、マイクロCTスキャン上のBV/TVは、0日目にアログラム群で著しく低いことに留意すべきです。 同種移植片は正常骨から、自家移植片は正常骨と骨粗鬆症骨のいずれかを持つ同じ動物から得られたものである。 海綿体の厚さは、正常骨では自家移植群で低く、骨粗鬆症骨では高い。 理論的には、骨粗鬆症の骨の密度低下とは逆の結果になるはずである。 しかし、これは骨粉の影響やチップの大きさ、可動性によるものである可能性がある。 興味深い点は、0日目から21日目までの成長速度が、自家移植群では16.4％しか増加しないのに対し、同種移植群では65.8％と速いことである。 21日目には、組織形態計測やマイクロアーキテクチャ解析によって定量化された自家移植と同種移植の間に差はありませんでした。
組織形態計測では、骨粗鬆症骨に移植材料を使用しようとすると、21日目に一般骨形成が減少することがわかりました（図6）。 ここでも注目すべきは、移植片が健康なドナーのものであるにもかかわらず、正常な骨での再生に比べ著しく低い再生率であることである。 このことは、骨粗鬆症の骨で移植材や医療機器をテストし、その有効性を十分に評価する必要性を強調している。 しかし、この正常骨と骨粗鬆症骨両方の組織での移植材のテストは、再生能力が不足しているように思われる。
ラットモデルでの骨粗鬆症の誘発は、以前検証されており、誘発までの観察の重要性が説明されている。 KinneyらはOVXによる海綿骨の変化を調べ、OVX処置により海綿骨は即座に継続的に減少し、50日後にはOVXラットは骨量の50％を失い、リバウンドの影響はないことを明らかにした。 Campbellらは、OVXラットモデルにおいて、12週間の骨量減少の詳細な縦断的時間経過を確立した。 この研究の結果は、ラットモデルにおいてOVX後最初の12週間で微細建築の変化が起こることを示している。 また、21日後の観察では、リバウンドはないと考えられる。 頭蓋形成術では、同種移植片が優れていることが示され、前方重要靭帯（ACL）では、自家移植片が骨形成に優れた効果を示したが、後方重要靭帯（PCL）では、2つの移植片は同じ結果であった。 したがって、臨床応用のために結果を比較する場合、正しい比較のために正しいグラフトを使用することが重要です。 陽性対照と陰性対照の両方に両方のグラフトを使用することで、最適な結果を得ることができます。 このことは、臨床的影響をより高くし、全体的に説得力のある結果をもたらします。
臨床的実施に直面するとき、さらに経済的および患者関連の結果に焦点を当てることが必要です。 例えばACL手術では、自家移植を使用する方がコストが低いことが報告されていますが、自家移植を採取する際に起こりうる副作用は、かなり深刻なものとなっています。 このことは、自家移植片を採取する際の方法論の選択にジレンマを与えていますが、さらに、両方の移植片材料に代わる別の代替物の必要性を要求しています。 この研究の強みは、標準化されたラットの脛骨欠損モデルと、骨粗鬆症の誘発が十分に検証されていることである。 しかし、この論文には過去の結果に依存するものはなく、骨粗鬆症の誘発は介入群の結果を評価するのと同じスキャナーで検証されている。 つまり、この研究の結果の信頼性が高まるのです。 さらに、異なるタイプの骨構造で結果と同じ方法を検証しているため、移植材の比較に最適であり、特に正常骨と骨粗鬆症骨の同種移植片は同じドナーのものである。 しかし、本研究の焦点は、移植材間の潜在的な効果を比較することであり、デザインモデルに対する特定のベースラインに従っていないことである。 もう一つの限界は、0日目にグループ間で有意差があることである。 しかし、評価が21日間に限定され、同種移植片はそのような短期間で同じ結果を得ることができたため、このモデルにおいて結果が検証されました。 結論
本研究では、ラット脛骨欠損モデルにおいて、21日間の観察で自家移植と同種移植が同様の骨形成能を有すると結論付け、同種移植が同種移植の良い代替となり得ることを示唆した。 さらに、ラットモデルにおける持続的な骨粗鬆症の誘発のためのOVX手術は、実現可能な方法である。
データの利用
この研究のデータは、組織形態測定によって分析され、すべてのデータは、この研究に組み込まれた分析のために行われたすべてのカウントと統計値を検証するデンマークのヴィシオファームのデータファイルのオーデンス大学病院整形外科&外傷科、南デンマーク大学、臨床研究所に保管されています。 マイクロCTスキャンはTBテープに保存された大きなファイルである。 本研究の結果を裏付けるために使用されたすべてのデータは、要請に応じて対応する著者から入手できる。
Conflicts of Interest
著者は利害の衝突を宣言していない。
Acknowledgements
我々は、南デンマーク大学の生物医学研究所のスタッフ、特に Anne Mette Durand が専門知識を共有したことに感謝したいと思う。 さらに，Gitte Højlund Reinbergには，研究期間中の支援に謝意を表する。 本研究は，デンマーク健康研究評議会（SSVF22-04-0705，MD）の好意により支援されている。