先天性精索静脈瘤の遺伝学

方法論的アプローチ

1968年にKaplanらがCFのほぼすべての男性がCBAVDによる閉塞性無精子症（OA）であることを明らかにして以来、CVDの遺伝学は歴史的にCFと関連している（Kaplan他、1968年）。 CBAVD の孤立型と嚢胞性線維症が同じ遺伝子に関連しているという概念は、1989 年に CFTR 遺伝子が同定された直後に確認されました (Dumur et al. 1990; Anguiano et al. 1992)。 しかし、すぐにCBAVDs症例の20〜40％がCFTRの変異と関連していないことが指摘され、遺伝的異質性の可能性が示唆された（Culardら、1994年；Chillónら、1995年）。 それにもかかわらず、25年間、CAVDの遺伝学はCFTRに限定されたままであった。 事実、ヒトの不妊の遺伝的決定要因の研究は、長い間、特定の方法論の制約を受けており、連鎖分析による従来の家族ベースのアプローチは、特に男性不妊の文脈では、心理社会的、文化的障壁のために適用できないことが多かった。 そのため、最近まで、非閉塞性無精子症（NOA）を探るために臨床でよく使われる遺伝子マーカーは、クラインフェルター症候群やY染色体微小欠失などの染色体異常に限られていました（Krausz 2011）。 しかし、この10年、次世代シーケンサー（NGS）の登場により、全エクソームシーケンス（WES）または全ゲノムシーケンス（WGS）と全トランスクリプトーム解析に基づく強力なアプローチの開発が可能になった。 最近、NOAの単発型に関与する約20の遺伝子が同定されている（Ghiehらによる総説2019）。 これらのほぼすべての遺伝子について、原因変異は、すべて劣性であり、血縁関係のある家族で同定されている（Yang et al.） 一方、我々の知る限り、OAの例外的な家族例は、血縁関係の文脈で観察されたことがなく、この限界は、新しいゲノムアプローチの設備にもかかわらず、CAVDで同定された新しい遺伝子の数がはるかに少ない理由を一部説明するものである。 しかし、近年、候補遺伝子の同定には、個々のゲノムの研究に基づくアプローチと、主に精巣上体の精管細胞のトランスクリプトーム解析に基づくアプローチの2つが補完的に寄与している。 前者は、iCBAVDとWES解析により同定されたADGRG2遺伝子の点変異（Patatら2016；Khanら2018）、およびアレイベース比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）解析により同定されたPANK2およびSLC9A3遺伝子のコピー数変動との関連性を確立するに至った（Leeら、2009）。 cDNAマイクロアレイやRNAシークエンシングを用いたトランスクリプトミックアプローチにより、多くの機能性候補遺伝子、特に発現が精管の細胞に限定される遺伝子や発現プロファイルが精管の特定の部位に特異的な遺伝子のターゲティングに成功しています（Browne et al.） ADGRG2やSLC9A3などのこれらの候補遺伝子のいくつかは、ノックアウトマウスで検証され、この動物モデルでの生理学が探求されている（Daviesら、2004年；Wangら、2017年）。 最近、WGS、全DNAメチローム解析、およびRNA配列決定を組み合わせた統合的マルチオミクスアプローチにより、iCBAVDの個体において、SCNN1BおよびCA12という2つの新しい候補遺伝子が特定された（Shen et al.2019）。 しかし、これらの進歩にもかかわらず、CAVDの少なくとも4分の1（そのほとんどがCUAVD）については、まだ遺伝子診断が行われていない。 これまで、これらの原因不明のCAVDの形態が単純な遺伝的変異の結果ではないという仮説はほとんど検討されてこなかった。 将来的には、エピゲノムを研究する新しい手法とバイオインフォマティクスツールの力によって、これらの孤立したCAVDの発生におけるエピゲノム制御の役割を特定することが可能になると予見されます。 しかし、このアプローチは、同種の民族出身の完全に表現型化されたCAVD患者からなる適切なサイズのコホートに適用されれば、より成功するでしょう。

CAVDに関与する遺伝子

NOAsの遺伝子決定論は、30以上の遺伝子（SPGF ）と著しい遺伝子不均質性を特徴とするが、OAのそれは非常に少数の遺伝子（Ghiehら2019）に限られる。 したがって、CAVDの白人症例の約4分の3は、2つの遺伝子の異常に関連していることが確定しています。 大多数はCFTR、少数派はADGRG2です（Patat et al.2016）。 SLC9A3などの他の遺伝子は、いくつかのiCBAVDに関与しているかもしれないが、非常に異なる生理病理学的役割を持つエピジェネティックまたは環境要因もある。

CFTR（MIM#602421）は1989年にRiordanら（1989）によってポジションクローンによって特定され、CFの責任を負う唯一の遺伝子を発見するという数年間の競合研究を終わらせた。 北欧系のCF患者の約半数は、3塩基対の欠失（NM_000493.3:c.1521_1523del）のホモ接合体であり、フェニルアラニン508を欠損している（NP_000483.3：p.Phe508del、遺 伝名：F508del）。 平均して、白人集団の40人に1人がp.Phe508del変異のヘテロ接合体であり、これは最も頻繁に起こるヒトの病原性突然変異の一つである（Kerem et al.1989）。 CFTRは、第7染色体7q31.2の長腕に250kbの領域を持ち、27個のコーディングエクソンを含み、いくつかの転写産物を生成するが、そのうちの1つである6.1kbのmRNAだけがCFTR（CF transmembrane conductance regulator）という1，480アミノ酸の機能タンパク質をコードしている。 CFTRは、多くの上皮細胞の頂膜に発現する糖鎖で修飾された膜貫通タンパク質で、主にcAMPによって制御される塩化物チャネルとして機能する。 CFTRは、ナトリウムチャネル（ENacs）、塩化物／重炭酸交換体、プロトン交換体（Na+/H+）、水チャネル（アクアポリン）などのイオン輸送体の制御に関与していることが多くの研究により示されています。 したがって、CFTR に依存する生理的過程は、分泌上皮液中のイオン、pH、水のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしている（Choi et al.2001）。 この30年間で、CFTRには2000以上の変異が報告されているが（https://www.genet.sickkids.on.ca/）、CFや予後の悪い他の疾患との相関から病原体（https://www.cftr2.org/）として分類されるのは4分の1未満である。 気管支（播種性気管支拡張症、MIM#211400）、膵臓（慢性膵炎、MIM#167800）、精管（先天性両側精管欠如、MIM#277180）など単一の器官に限定されたものです。 嚢胞性線維症の基準をすべて満たすわけではないが、CFTR機能障害に関連するこれらの疾患は、CFTR-RDという総称でグループ化されている（Bombieri et al.2011）。 CFTRのすべての領域は、プロモーター領域および深部イントロン領域を含む疾患原因変異によって影響を受ける可能性がある（Fengら、2019；Bergougnouxら、2019）。 CFTRの生合成および機能に対する影響に応じて、病原性アレルは2つの主要なカテゴリーに分類されます。 ホモ接合状態で、常にCFと関連しているCF原因変異体（「重度」とも呼ばれる）と、CF患者で観察されたことがなく、それゆえ誤って「軽度」アレルと呼ばれる非CF原因変異体である。 CFの原因となる少数の対立遺伝子は、膵臓の機能が保たれていることが多い、多かれ少なかれ重度の嚢胞性線維症の様々な臨床形態で観察されている。 VCC（Variants of varying clinical consequence）と呼ばれるこれらの対立遺伝子の病原性は、複合型対立遺伝子とのシス結合など、ほとんど知られていない遺伝的要因や未知の非遺伝的要因に依存する可能性がある。 CF の原因となる変異体とは異なり、非 CF の原因となる変異体は、不完全な CFTR 機能障害を引き起こす。 臓器によっては、CFTRの残存活性が低すぎて恒常性を維持できない場合、CFTR-RDが出現することがある。 したがって、CFTR-RDを持つ被験者は、一般的に非CF原因バリアントとCF原因バリアントがトランス結合していることが多く、まれに他の非CF原因バリアントが結合していることもある。 Xp22.13に位置するADGRG2 (MIM#300372) は、約10個の転写産物を生成する29個のエキソンからなり、そのうち最も長いエキソン3-29は、接着Gタンパク質結合受容体G2 (ADGRG2) をコードするオープンリーディングフレームを3.1kb有している。 そのcDNAは、1997年にOsterhoffらによって、ヒト副睾丸cDNA細胞のライブラリーの差分スクリーニングの後に最初にクローニングされ、その中でHE6（ヒト副睾丸特異的タンパク質6の意）と名付けられたこのクローンが膨大に表現されていた。 HE6タンパク質は、1017アミノ酸の配列を持ち、7つの膜貫通ドメインが高度に保存されていることから、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）スーパーファミリーに属し、当初はGPR64と呼ばれていたものである。 HE6/GPCR64の細胞外部分の構造と自己触媒特性から、最終的に接着GPCR（aGPCR）のGサブファミリーに分類された（Hamann et al.2015）。 ADGRG2は、雄の精管の近位部（https://proteinatlas.org）、正確には精巣上体管の排出管と初期部の上皮にほぼ独占的に高発現する高グリコシル化タンパク質である。 ADGRG2の免疫標識は、主副睾丸細胞の立体繊毛と、精巣から分泌された液体の90％が再吸収される排出管の非繊毛細胞の微絨毛に特に強く見られる（Kirchhoff et al.2008；Patat et al.2016）。 このプロセスにおけるADGRG2の関与は、最初にマウスのHE6/GPR64ノックアウト（標的破壊）により示唆され、これは、ヘミ接合体の雄では、精巣内の液体の蓄積と、閉塞性不妊の表現型をもたらす放出管での精子停滞をもたらす（Davies et al.2004）。 ADGRG2は、リガンドが不明で、シグナル伝達経路も部分的に解明されているオーファン受容体である。 多くのaGPCRと同様に、成熟したADGRG2は、細胞膜に固定された大きなC末端断片（CTF）に非共有結合した細胞外N末端断片（NTF）中のGPCRタンパク質分解部位（GPS）を含む高度な保存ドメインで切断されてできた異種二量体である（Obermann et al.2003）。 この2つのサブユニットが内因性アゴニストの作用下でどのように協調してシグナルを伝達するのか、また、それぞれ別の特異的機能を持つのかについては、いまだ解明されていない問題である。 しかし、切断によって生じたCTFの細胞外末端には、アゴニストとしての性質を持つStachel配列が担われていることが示されている（Demberg et al.） さらに、in vitroおよびin vivoモデルで得られた最近の実験データから、GsおよびGqタンパク質を介したシグナル伝達を介して、ADGRG2、はそれぞれc-AMPおよびPKC活性を調節することができることが示されている（Demberg et al.2017; Balenga et al.2016; Zhang et al.2018 ）。

CAVDの原因変異、タイプ、疫学

CFTR変異

CFTR遺伝子が特定されてから1年もしないうちに（Riordanら1989）、DumurらはiCBAVDの不妊男性の小シリーズでp.Phe508del変異の異常な高頻度を観察した（Dumurら1990）。 この発見は、iCBAVDが嚢胞性線維症の単症状であるかもしれないという仮説を支持するものであり、医学的に大きな影響を及ぼした。 それ以来、精子の外科的採取と卵細胞質内精子注入法（ICSI）による医療補助生殖技術（ART）を受けるすべてのiCBAVDの男性は、嚢胞性線維症の子供を持つリスクが高いと見なされるようになった（Anguianoら、1992年）。 その後、Chillonらは、CFTRクロライドチャネル機能の完全な喪失を引き起こすCF原因変異のみを有するCF患者とは異なり、iCBAVD患者は、3〜8％のCFTR活性の低下または部分的な活性と相関するため、いわゆる「軽度」変異のCFTRコピーを少なくとも一つ有することを確認した（Chillonら、1995年）。 この状況は、イントロン9のポリチミジン（Tn）多型の変異体（NM_000493.3：c.1210-12T）、いわゆるIVS8-5Tアレル（5Tアレル）であり、その頻度はiCBAVD被験者において4〜5倍高い（De Sousaらによるレビュー2018）ことが良く示されている。 この5Tアレルは、正常なCFTR mRNAの著しい減少につながるエクソン10のスキップを促進するスプライシングに劇的に影響する（Chu et al.1993）。 ヨーロッパ系の iCBAVD 患者の 3 分の 1 までが、CF の原因となる変異（最も多いのは F508del で、5 T アレルがトランス）を持つ複合ヘテロ接合体である (Chillón et al. 1995)。 しかし、この遺伝子型はCFを持つ子供を持つ受胎可能な父親で観察されていたため、Cuppensらは、エクソン10スキップに関するこの5Tアレルの浸透率は、主にポリT配列の上流のポリT多型配列（NM_000493.3：c.1210-34TG）のサイズに依存していることを示した（Cuppens et al.1998） 。 したがって、健常者では圧倒的に多型のTG(11)5T (NM_000493.3:c.1210-34TGT) が見つかるが、iCBAVD被験者では最も頻繁に見つかるのはTG(12)5Tの組み合わせであり、はるかに稀なTG(13)5Tアリルは常にiCBAVD被験者で確認される (Groman et al. 2004). 過去20年以上にわたる多くの研究により、民族や地理的な起源に応じた頻度を特定することで、CBAVD対象者のCFTR変異スペクトルを特徴付けることが可能になった（Yu et al.によるレビュー 2012年）。 CFTR の大規模再配列（Taulan et al. 2007）を含む同じ種類の重篤な変異が CF-CBAVD と iCBAVD の両被験者に見られる一方で、iCBAVD の CFTR 変異スペクトルは、CF を引き起こさない変異が多く、そのほとんどが膵臓病、播種性気管支拡張 症、副鼻腔障害などの他の CFTR-RD 表現型と関連している点で大きく異なっている (Bombieri et al.2011)。 これらの「軽度」変異には、主にスプライシングに影響を与えるイントロン変異（その中で最も頻度が高いのは5T対立遺伝子）、およびクロライドチャネルの機能に影響を与える多数のミスセンス変異（白人で最も頻度が高いのはp.Arg117His (R117H) 変異）があります（Casals et al.2000; Claustres et al.2000）. これらの非CF原因変異のほとんどは、最も頻度の高いCF原因変異を主に対象とした、古典的なCF集団のために設計されたルーチンパネルでは検出されない（市販のキットが多数ある）。 そのため、CBAVDやその他のCFTR-RDの分子診断では、第一選択検査として、2つの主要な「軽度」変異であるR117Hと5Tアレルを含むCFTR検査を選択することが推奨されます（以下の「臨床現場への影響…」の章を参照ください）。 この検査で結論が出ない場合は、少なくとも全エクソンとその近傍のイントロン領域の配列決定、大規模な再配列の検索を含む、CFTRの包括的な特性評価を実施する必要があります。 新世代シーケンサー（NGS）を用いた分子診断法は、点変異だけでなく、大きな欠失や重複の検出にも用いられるようになってきています。 パネルに適用できるこれらの新しい遺伝子スキャン法により、エクソンごとに行う手間のかかるサンガーシークエンスや半定量PCR法（MLPA、QMPSF、qPCRなど）を避けることができる。

CAVD患者におけるCFTR変異の頻度は研究ごとに異なり、おそらく募集バイアス、コホートサイズ、ジェノタイピング法の不均一性、多くの被験者がCFTRの部分解析を受けていることが原因となっている。 しかし、いくつかの対立遺伝子の頻度は、白人のCAVD患者と嚢胞性線維症がはるかにまれな非白人国の患者で非常に異なっていることは明らかである。 特にF508del変異は、中国人のiCBAVD患者には例外的に検出されるが、北欧のiCBAVD患者の3分の1までが保因者であることが分かっている。 一方、アジア系のiCBAVD患者は白人よりも5T対立遺伝子の保因者であることが多く（表1）、一般集団におけるこの対立遺伝子の頻度は世界的にほとんど変わらない（5％）。 全体として、Yuら（2012）が発表したデータのメタアナリシスでは、白人のiCBAVD患者の約80％がCFTRの少なくとも1つの変異の保因者であることが示されています。 最も網羅的な研究では、変異が検出されない被験者が6％残っています（Ratbi et al.2007）。 これらの患者の中には、単純なヘテロ接合体（白人集団で3%）や、中立的（CFやCFTR-RDの原因ではない）である可能性のある意義不明の変異を持つ者がいることを考慮すると、CFTRはiCBAVD症例の75-80%に関与していると考えることができる。 したがって、iCBAVD患者の約4分の1については、CFTRの関与が明確に証明できないのに対し、CF患者の場合は、99%の症例で2つの変異アレルの特徴を明らかにすることができます（表1）。 CUAVDについては，包括的な遺伝子スキャンを行った結果，被験者の30～50%が少なくとも1つのCFTR変異を有しており，これはCUAVDの半数以上がCFTR関連ではないことを意味する（Schlegelら1996；Casalsら2000；Caiら2019；Mieussetら2020）。 CFTR異常が1つだけ、あるいは全く検出されていないCAVD患者では、腎臓の異常の存在が非常に有意に高い（Augartenら1994；Schwarzer & Schwarz 2012）。 したがって，CBAVD（20％）とCUAVD（50％）のCFTR変異非検出率の差は，両群で観察される片側腎不全の頻度の差（それぞれ5％対25％）に少なくとも部分的に関連していると想定できる（Weiskeら 2000; McCallumら 2001; Kolettis and Sandlow 2002; Yangら 2015）。

ADGRG2変異

2016年に、ヨーロッパ系の379人のiCBAVD男性の大規模レトロスペクティブシリーズから、CFTR変異も関連腎異常もない26人コホートを慎重に選択後、Patetら, Inc.が、CFTR変異を持たない26人のコホートと、CAVD型と関連腎異常がない26人のコホートとを比較した結果、CFTR変異を持つ26人のコホートは、CAVD型と関連腎異常がない26人のコホートと比較した結果、最も頻度の高いアレルを持つ26人のコホートの平均頻度が高かった。 は、4人の被験者において、X連鎖ADGRG2遺伝子（MIM#300572.0001_3）の3つの半接合型切断変異を確認しました（Patat et al.2016） 。 iCBAVD表現型におけるこれらの変異の因果関係の確立は、一連の議論に基づくものであった。 (i）雄のADGRG2ノックアウト（KO）マウスは、他の有意な異常なしにOAを発症する（Daviesら、2004）、（ii）4人のうちの1人の副睾丸生検の組織検査では、異常に拡張した排出管上皮にADGRG2の発現がないことを示した、（iii）トランケート変異の1つが母親のリンクによって関係する2人の不妊の人（甥と母親の叔父）に確認された、など。 その後、3つの論文（Yang et al. 2017; Yuan et al. 2019; Khan et al. 2018）が、病原性CFTR変異を持たないアジア出身の6人のiCBAVD患者におけるADGRG2の5つの新しい希少変異の同定を報告している：パキスタン出身の不妊兄弟におけるものを含む病原性と分類された2つのナンセンス変異（Khan et al. 2018）とGPS領域に影響を及ぼすものを含む病原性と分類された3つのミスセンス変異（Yang et al.） これら6名の患者さんには腎臓の異常はありませんでした。 最近、Paginらも、0または1つだけのCFTR欠損対立遺伝子を有する53人のフランス人CAVD患者のコホートにおいて、6つの新規ADGRG2切断型変異を報告している。 この研究では、ADGRG2とCFTRが関与する二遺伝性遺伝の仮説を支持する説得力のある証拠を得ることはできなかった。 彼らは、ADGRG2の不活性化が、CFTR機能障害に関連しない約20％のCAVDの原因であると結論づけた。 さらに、彼らは彼らのコホートの8人のADGRG2変異患者の中に孤発性腎の症例を見つけなかった（Pagin et al.2019）。 興味深いことに、URAを有するiCBAVD患者28人のコホートにおいて、PatatらはADGRG2およびCFTR変異を同定しなかった（個人資料）

その他の変異

我々の知る限り、CFTRおよびADGRG2以外に、iCBAVDとの相関性の疑いがある変異はPANK2およびSLC9A3遺伝子に関わるCNVだけである。 現在までのところ、これらの CNV は台湾の iCBAVD 患者にのみ記述されている。 他のアジアの集団と同様、台湾では CF と CFTR-RD はほとんど観察されず、不妊の台湾人 iCBAVD 男性で頻度が有意に増加している IVS8-5T アレルを除けば、病原性の CFTR アレルの特徴はほとんど明らかにされていない (Chiang et al. 2009)。 HS Chiangのチームは、台湾のiCBAVDの小さなコホートでアレイCGHと定量的リアルタイムPCRを用いてCNVを調査することにより、1人の個人でパントテン酸キナーゼ2（PANK2）遺伝子のホモ接合性欠損（Lee et al. 2009）、29人中11人で溶質キャリアファミリー9アイソフォーム3遺伝子（SLC9A3）のコピー欠損（Wu et al. 2018; Chiang et al. 2019によるレビュー）であると確認した。 PANK2は、KOマウスが無精子症であったことから、生殖関連遺伝子の候補として選ばれた（Kuo et al.2005）。 しかし、それはNOAであり、この状態はパントテン酸キナーゼ関連神経変性症（MIM#234200）の患児ヒトでは観察されない。 現在までに、PANK2の欠失に関連したCBAVDの症例は報告されていない。 従って、相関は不明であり、逸話的な観察にとどまっている。 一方、SLC9A3がCBAVDの表現型に関与するという同じチームによって得られた実験データは、より説得力のあるものである。 実際、これらの著者らは、成体雄マウスSLC9A3-/-が、精管および精嚢の長期進行性萎縮を伴う遠心管の構造的および機能的異常により閉塞性無精子症を発症することを示した（Wu et al.2019; Chiang et al.2019 ）。 驚くべきことに、著者らは、これらのSLC9A3-KOマウスの精巣上体および精管のCFTRの劇的な減少を観察し、iCBAVD決定論における2つの遺伝子の相互依存的役割を示唆した（Wang et al.2017）。 しかしながら、雄マウスの生殖管の生理学におけるSLC9A3の役割に関するこれらの非常に啓発的な観察にもかかわらず、この遺伝子のコピーの喪失とヒトにおけるiCBAVDとの関係は、まだ十分に理解されていない。 SLC9A3の劣性変異がナトリウム分泌による先天性下痢の重症型（congenital secretory sodium diarrhea, MIM#616868）を引き起こすこと、SLC9A3の完全欠失を含む機能喪失型変異がヘテロ接合性の父親によって伝えられることが示されていること（Janecke et al. 2015）、台湾の患者のCBAVDはSLC9A3ハプロ不全だけで説明できないこと、を考慮すると、この問題は解決することができる。 さらに、Wuらは、iCBAVDを発症した台湾人患者29人のうち、6人（20.7%）がCFTR TG（12）5TまたはTG（13）5Tアレルのホモ接合体または複合ヘテロ接合体を認め、この遺伝子型は単独でiCBAVDを引き起こすのに十分と考えられることを研究報告している。 これらの6人のうち、2人はSLC9A3のコピーを1つだけ持っていた。 この同じコホートから、他の12人のiCBAVD患者は、TG（12）5TまたはTG（13）5Tアレルのヘテロ接合であり、その半数はSLC9A3の欠失も持っていた（Wuら、2019年）。 5TアレルのようなCFTR変異が関与するジゲニズムの可能性は、まだ推測の域を出ていない。 なお、これら29名の台湾人CBAVD患者のうち、一側性腎欠落を有する者はいなかった。