バッチリアクターにおける脱窒菌の微生物多様性評価

BIOPROCESS ENGINEERING

Evaluation of microbial diversity of denitrifying bacteria in batch reactor

S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*

ABSTRACT

工業活性汚泥プラントにおける微生物群は脱窒プロセスに寄与していると考えられるが、脱窒反応器に存在する微生物に関する情報はまだ乏しい。 無機窒素化合物の除去は、脱窒の生物学的プロセスに炭素源を添加することによって達成できる。 エタノールは、サトウキビから大規模な生産を行っているブラジルのような熱帯諸国では、炭素源として経済的に実行可能な代替物である。 本論文では、バッチ式嫌気性反応器において活性汚泥に硝酸塩とエタノールを添加することに成功したことを報告する。 運転時間は61.5時間で、硝酸塩の消費は42.5時間、亜硝酸塩の生成は2.0 mg/L、エタノールの消費は830.0 mg/Lであった。 運転開始時の最確数による脱窒細胞数は終了時よりも少なく、活性汚泥からの接種物の脱窒処理能力を確認することができた。 細胞数から得られたサンプルは、Acidovorax sp.、Acinetobacter sp.、Comamonas sp.および未培養菌であることが確認された。 したがって、これらの種はバッチリアクターにおける硝酸塩の還元とエタノールの消費に関与している可能性がある。

キーワード 活性汚泥システム; Acidovorax; Acinetobacter; Nitrate; Ethanol.

INTRODUCTION

脱窒能力を持つ微生物は、土壌、底質、淡水、海、廃水処理システムなど自然界に広く分布する（Park & Yoo, 2009）。

家庭用および工業用下水処理場からの多くの接種物は、主に活性汚泥システム（Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009）において脱窒を促進するために生物学的窒素除去が起こり、すなわち従属栄養無酸素状態において、有機炭素源が電子ドナーとして作用し硝酸を窒素ガスに還元する(Canto et al., 2008)、脱窒細菌が含まれているかもしれない。 従属栄養脱窒には、有機炭素とエネルギー源の存在が必要である（Nava et al.、2010）。

脱窒細菌の多くは、アシドボラックス、コマモナス、アシネトバクターなど、プロテオバクテリア門に包含される。 このような細菌は、廃棄物処理、特に活性汚泥系に存在することがあり、硝酸塩とエタノールなどの外来炭素源から分子状窒素を形成することが可能である。 完全脱窒、すなわち硝酸塩から窒素ガスへの変換は、通常は空気中の酸素をエネルギー源とする細菌種が仲介するが（好気性呼吸）、酸素の代わりに硝酸塩および亜硝酸塩を利用する能力も有する（無酸素状態）。 したがって、これらの細菌は、硝酸塩が存在しない場合は好気性で増殖し、硝酸塩が存在する場合は無酸素状態で増殖することができる。 硝酸塩の分子状窒素への変換は、無酸素呼吸とも呼ばれる（Park & Yoo, 2009）。

メタノール、エタノール、グルコース、酢酸、アスパラギン酸またはギ酸、芳香族化合物など、様々な有機化合物が使用されてきた（Queiroz et al.） しかしながら、飲料水の脱窒に関する公表された研究のほとんどは、メタノール、エタノールおよび酢酸の使用を含む（Park & Yoo, 2009）。 エタノール（Daniel et al., 2009）、グルコースおよび酢酸は、脱窒に成功した外部電子供与体の一部である。 特にブラジルでは、エタノールが実現可能な代替手段となっている（Gavazza dos Santos et al.） ブラジルでは、1975年のアルコール国家計画（1975-1985）以来、エタノールが大規模に生産されている。 ブラジルはほぼ 2.6 x 108 トンのサトウキビを生産し、324 の製糖工場で砂糖とエタノールを生産している（Borrero et al.、2003）。 サトウキビから豊富に生産され、通常、他の便利な炭素源よりもコストが低い。 それにもかかわらず、外来プロセスのための追加の電子供与体源の必要性は、運用コストを増加させ、おそらく革新的な嫌気性プロセスベースの技術の使用の欠点となる（Gavazza dos Santos et al, 2004）。

細菌のエネルギー反応を記述する化学量論関係（Park & Yoo, 2009）は、エタノールを炭素源として使用する場合、次のように書かれます：

0.69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.69、NO3 + H+ → 0.69、NO3 + H+ → 0.69、NO3 + H+ → 0.69、NO3 + H+ → 0.69。14 C5H7NO2 +0.43 N2 + 0.67 CO2 + 2.07 H2O

この式は、硝酸塩の異化に必要なエタノールの化学量論を明らかにするが、脱酸素と細胞合成には、さらにエタンが必要である。 実際には、必要なエタノールの25%から30%がバクテリアの細胞合成に使用される。 溶存酸素が存在する場合、エタノールの必要量はそれに比例して多くなる。 したがって、基質と硝酸塩の重量比（C:N03）の一般的な作業値はほぼ3である（Park & Yoo, 2009）。

バッチリアクターと脱窒プロセスに関する文献は数少ない。 これらの構成は、栄養所要量を調査するために使用することができる（Maintinguer et al.） 複合糖質による脱窒プロセスは、これらのシステム内に存在する粒子状有機物が、デンプンを用いたような他の構成での操作を困難にするため、バッチリアクターで評価されている（Iamamoto, 2006）。 さらに、連続フローリアクタと比較して、バッチリアクタではすべての運転期間においてバイオマスが保持されたままである。 これらの事実は、バッチリアクターで検証された総硝酸塩消費量に貢献し得る(Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004)。

活性汚泥接種による硝酸塩除去は、特に温帯の国々で研究が行われてきた。 ブラジルのような熱帯の国々では、活性汚泥を用いた硝酸塩除去や分子生物学的な研究の報告はほとんどない。 そのため、本研究の第一の目的は、熱帯地域の活性汚泥を植菌して脱窒プロセスを評価することであった。 本研究では、分子生物学的手法と伝統的な微生物学的手法を用い、エタノールと硝酸塩を供給するバッチ反応器における脱窒の微生物多様性について検討した。

MATERIAL AND METHODS

Batch Reactor

実験はVolkswagen São Carlos（São Carlos SP – Brazil）の下水処理場活性汚泥システムからの汚泥を用いて実施された。

バッチ式反応器は2LのDuran®フラスコに3連で用意し、1Lは反応液、10% (v/v) 植菌液 (100 mL/L) とした。

反応器は液を分配後20分間N2雰囲気 (99.99%) にさらされた。 その後、ブチルゴム栓でキャップし、ラップして25 ºC ± 1 ºCに保ち、120 rpmで撹拌しながら61.5時間運転した。

Physical-Chemical and Chromatographic Analysis

APHA, 2005に従って全揮発性固体（TVS）と硝酸消費量を分光測色法で測定した。 亜硝酸塩の分析は、フローインジェクション（FIA APHA, 2005）で行った。 揮発性脂肪酸およびアルコールは、炎イオン化検出器、ヘッドスペース用オートサンプラー COMBI-PAL – AOC model 5000 および HP-INNOWAX カラム（30 m x 0.25 mm x 0.25 mm フィルム厚）を備えた Shimadzu GC-2010 でガスクロマトグラフ法により、Maintuer et al.による測定が行われ た。 2008）。

脱窒菌の定量

脱窒菌の最確数（MPN）は、液体試料に適応したTiedje（1982）に従って、バッチリアクターの運転開始時と終了時に5倍の希釈で実施した。 MPN法による細胞数は、APHA, 2005に従って、15日間培養した後に行った。 MPNアッセイで使用した培養液組成と、硝酸塩およびエタノール濃度は、前述のようにバッチリアクター操作のものと同様であった。

分子生物学

16SrRNAの分析用サンプルは、バッチリアクターから試験終了時に脱窒細菌の最高陽性希釈数（MPN）を得た。

試料の全ゲノムDNAは、Griffithsら(2000)修正による既述のように、ガラスビーズ（Sigma）を用いた細胞溶解とフェノール-クロロホルム抽出後に取得された。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅は、16S rRNA遺伝子用の細菌ドメインプライマーセット、27フォワード（5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′ ）と1100リバース（5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3’）（Lane, 1991）を用いて実施した。 PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22,331) による増幅は、94 ºC で 5 分間の初期変性、94 ºC で 45 秒間の変性、55 ºC で 45 秒間のアニール、72 ºC で 1.45 分間の延長、72 ºC で7分間の最終延長を 30 サイクルと 4ºC で冷却して実施された。

PCR (Polymerase Chain Reaction) 産物 (16S rRNA) のサンプルは、メーカーの仕様書に従ってプラスミドベクターpGEM (Promega Easy Vector System I) にクローン化した。 クローンを無作為に選択し、PCRで増幅した。 ヌクレオチド配列決定は、M13フォワードプライマー（50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30）（Messing, 1983）を用いて、製造業者の指示に従って自動ABI 310 PRISMシーケンサー（Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA）上で行った。 PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) は、94 ºC で 2 分間の初期変性、94 ºC で 1 分間の変性、55 ºC で 1 分間のアニーリング、72 ºC で 1 分間の伸長、72 ºC で 7 分間の最終伸長を 25 サイクルで行い、4 ºC で冷却することで増幅を行った。

塩基配列は、Seqmanプログラム（Lasergene DNAstarパッケージ）を用いて、ベクターからのシグナルや低品質塩基を除去してアライメントした。 並んだ配列は、データベースGenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) およびRibosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu) で表される16S rRNA遺伝子生物の配列と比較して、NCBIウェブサイトのBLAST検索プログラムで決定されました。 系統樹は、プログラムMEGA version 4.1 (Kumar et al., 2008)を用いてNeighbor-Joining法 (Saitou & Nei, 1987)により構築した。 木構造の信頼性を評価するために、1000反復のブートストラップ再サンプリング分析を行った。 8761>

RESULTS AND DISCUSSION

硝酸塩は42.5時間の運転で完全に消費された(図1)。 亜硝酸塩の発生は減少し（18.5時間で2.0 mg/L）、運転後23.5時間以内に発生した。 初期濃度1,650 mg/Lに対して、13.5時間後に1.06 g ethanol/L（36%消費）が観察された。 実験終了時のエタノール消費量は54%（61.5時間で0.77 g/L）であった。 これらの結果は、Gusmão ら（2006）の結果とほぼ同じであった。 著者ら（op.cit.）は、家禽屠殺場（DAKAR-Tietê SP Brazil）からの廃水を処理する上向流嫌気性スラッジブランケット（UASB）の粒状スラッジの精製細胞を用いて、硝酸塩（350 N-NO3 mg/L）, エタノール（377 mg/L）, ベンゼン（10 mg/L） を炭素源として14時間の運転で98.9%の硝酸塩消費を観察した。

実験開始時にメタノール（197.78 mg/L）およびn-ブタノール（23.50 mg/L）が検出されました。 これらのアルコール（メタノールとn-ブタノール）は、接種物に含まれていた可能性がある。 これらのアルコールの濃度は試験終了までほとんど変化せず、この脱窒条件では消費されないことがわかった(図2)。

最大酢酸発生量は、運転時間61.5時間で16.7 mg/Lであった。 バッチリアクターの運転開始時と終了時のSTVの値はそれぞれ5.14 g/Lと11.40 g/Lであり、バイオマスが122%増加したことが分かる。 これらの結果は、バッチリアクターに課された運転条件が脱窒条件下での細菌コンソーシアムの発達と永続性に有利であることを示した。

この研究では、リアクターに異なる構成を用いた他の著者によっても記述されているように、脱窒のプロセスが観察されている。

Callado & Foresti (2001)は、嫌気性/好気性/嫌気性連続バッチリアクタで、家庭下水を模した合成基質を供給して炭酸物質の最大割合を除去し、同じバッチサイクルで基質の硝化、脱窒および生物学的リン酸除去を促進するために嫌気反応器を動作させた。 このシステムは、温度28±1 ºCで、12時間×84サイクルで41日間運転されました。 著者ら（op.cit.）は、脱窒は反応段階において好気的条件と無酸素的条件が交互に起こることを確認した。 また、酢酸ナトリウム（500 mg/L）を無酸素相の最初に添加した場合のみ、両過程が発生した。

Etchebehere et al. (2001) は、硝酸カリウム (20mmol/L) を用いた嫌気性バッチリアクタで、脱窒のための炭素源として酢酸 (40mmol/L) とグルコース (13mmol/L) を、3種類の植菌でテストしました：衛生埋立地の浸出液から炭素と窒素を除去する無酸素リアクタ（ラボスケール）からのスラッジ；麦芽を処理する UASB メタン生成リアクタからのスラッジおよび酢酸と硝酸を供給した無酸素リアクタのスラッジです。 硝酸塩は、本研究で観察されたように、試験した3つのサンプルの汚泥から完全に消費された。 著者ら（op.cit.）は、酢酸塩はグルコースよりも優れた炭素源であると結論付けた。

Gavazza dos Santosら（2004）は、家庭下水処理場からの硝化排水を模した合成排水を供給するバッチリアクターで行われた脱窒プロセスを、3つの電子供与源：メタノール（53.3 mg/L）、エタノール（38.3 mg/L）、メタン（合成排水に加えて）を使用して検討した。 著者ら（op.cit.）は、最も効果的な電子供与体はエタノールであり、この研究で観察されたように、亜硝酸塩と硝酸塩を完全に除去することができたと観察している。

Iamamoto（2006）は、デンプンとアンモニウムを交互に無酸素と好気性の条件（2時間/2時間サイクル）と2mg O2/Lで供給する連続バッチ反応器で、以下の濃度で84％以上の窒素除去率を得た。 125 mg N-NH4/L と 0.95 g starch/L, 250 mg N-NH4/L と 1.9 g starch/L, 500 mg N-NH4/L と 3.0 g starch/L, 2 mg O2/L, 3 mg O2/L, 4 mg NH4/L と 3.0 g starch/L である。8 g starch/L、下水処理場（Flores da Cunha Rio Claro SP Brazil）の活性汚泥システムからの植菌で実施。 エタノール（1,500 mg/L）も、500 mg NH4-N/Lとともに炭素源として試験した。 著者ら（op.cit.）は、本研究で観察されたように亜硝酸塩および硝酸塩の除去が完全（100%）であることを観察し、脱窒プロセスにおけるエタノール使用の実現可能性を示した。

バッチリアクターの運転開始時のMPNによる脱窒細胞数は、運転終了時のMPN/mL (1.2 x 1019) より低かった（図 3）。 これらの結果は、後述する文献で報告されている結果よりも高いものです。

Etchebehereら（2001）は、酵母エキス（0.5 g/L）、酢酸カリウム（1.84 g/L）および硝酸カリウム（0.72 g/L）を加えた基礎培地で脱窒細胞を最確数（MPN）で数え、浸出水処理システムの無酸素リアクターの汚泥を使用して9，6 x 106 MPN/mL が得られています。 Callado and Foresti（2001）は、嫌気/好気/嫌気連続バッチリアクターで酢酸ナトリウムを炭素源として使用し、運転開始時のMPN脱窒菌（2.5 x 106 MPN/mL）の方が終了時（3.5 x 105 MPN/mL）よりも多いことを見いだした。 著者ら（op.cit.）は、この減少は脱窒プロセスに影響を及ぼさないと結論付けた。

山本（2006）は、250 mg N-NO3/L (3.9 x 106 MPN/mL) と500 mg N-NO3/L (1.) の連続バッチ反応器の運転終了時の脱窒菌のMPNに同じオーダーを得た。8761>

脱窒細菌は、無酸素反応器内の栄養条件によって有利に作用した。 この事実は、活性汚泥からの植菌が脱窒処理に有効であることを確認した。

微生物コンソーシアムの16S rRNA遺伝子断片のクローニングと配列決定のために分析した試料から50のクローンが得られた。 ただし、180塩基未満のクローンは、後述のデータベースと比較するには不十分であったため、系統解析に組み入れなかった。 MPN最高希釈陽性試料（10-18）からクローニングとシークエンスによる配列を得た（表1）。

Acinetobacter sp.が類似性で同定された。 98％（クローン1，8，13，15，33，43，45，52，54，62，67，83および2，4，18，20，23，27）および99％（クローン6，15，16，37，38）であり，類似性が高いことが確認された。 グラム陰性菌で、非運動性、オキシダーゼ陰性、非発酵性、対になっており、プロテオバクテリア門、モラクセラ科に属している。 土壌中の重要な微生物であり、芳香族化合物の無機化などに貢献する（Geng et al.、2006）。 Wangら（2007）は、活性汚泥システム（Jizhuangzi Tianjin – China）の試料からAcinetobacter株を分離した。 この菌株は、遊離細胞および固定化細胞により、フェノール（1.1 g/L）を生分解する能力を有していた。 Gengら（2006）は、活性汚泥処理システム（シンガポール）の試料からフェノール分解細菌を分離した。 生化学的試験により、これらの微生物はエタノール、グルコース、スクロース、およびトルエン、フェノール、安息香酸などの芳香族化合物の存在下で増殖することが示された。 これは新種、Acinetobacter EDP3として記載された。 著者ら（op.cit.）は、この種はフェノール化合物の除去や土壌中のフェノールの原位置バイオレメディエーションに利用できると結論づけている。 Caiら（2009）は、ヒ素に汚染された土壌から58の耐性菌を同定した。 Acinetobacter、Agrobacterium、Arthrobacter、Comamonas、Rhodococcus、PseudomonasおよびStenotrophomonasの菌株が高濃度（20 mM Ar/L）で同定された。 本研究で同定されたAcinetobacter sp.は、与えられた運転条件により増殖し、脱窒に寄与する可能性があることがわかった。

Clone 24と26はComamonas sp.に類似し、類似度はそれぞれ98%と97%であった。 ComamonasはProteobacteria Phylum, Comamonadaceae Familyに属するグラム陰性菌である。 Etchebehereら（2001）は、Montevideo（ウルグアイ）の埋立地浸出水処理に使用されている無酸素リアクターからグラム陰性脱窒細菌を分離した。 分離された菌種はComamonas terrigenaと類似性を有していた。 しかし、この微生物は新種とみなされ、Comamonas nitrativoransと名付けられた。 この菌はグラム陰性菌で、極性鞭毛が可動し、好気性で従属栄養性であると説明された。 この種はエタノール，酢酸，酪酸，硝酸，亜硝酸で増殖し，硝酸をN2に還元できる。

したがって，本研究で同定したComamonas種は活性汚泥の接種物中に存在し，試験で生じた脱窒に寄与しうるものであった。

クローン25、28、34、36、42、65はAcidovorax sp.に類似し、それぞれ99%、97%の類似性を示した(表1)。 Acidovorax sp.はProteobacteria Phylumに属し、活性汚泥系で容易に発見される。 活性汚泥法では、多くのAcidovorax属細菌が微生物処理プロセスの制御微生物として働いている。 いくつかのAcidovorax種は、プラスチックの生分解や、脱窒によるニトロフェノール、ニトロベンゼン、ポリ塩化ビフェニルなどの他の有機汚染物質の除去に利用されている（www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html）。 Khanら（2002）は、都市下水の処理に使用されている3つの活性汚泥システム（名古屋、大阪、豊橋）からPHBV（ポリ-3-ヒドロキシブチレート-コ-3-ヒドロキシバレレート）を分解する脱窒細菌種を分離した。 解析した37クローンは、β-proteobacteriaに属する生物と類似性を示した。 ほとんどのクローンが Acidovorax 属に類似しており、この種が脱窒条件下での PHBV 分解に関与していることが確認された。 Gentile ら（2007）は、エタノール（40.0 g/L）と乳酸（40.0 g/L）を炭素源として運転する脱窒反応器から Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium および Achromobacter と同様の種を分離し、個別に電子供与体の試験を行い、窒素源として硝酸（ 1.9 g NaNO3/L; 2.3 g KNO3/L） が使用されていることを確認している。 著者ら（op.cit.）は、硝酸塩からN2への完全な還元はAcidovorax種が行い、亜硝酸塩への不完全な脱窒はAchromobacter sp.とDelftia acidovoransが担当すると結論づけた。 表1に示すように，Acidovorax属の未培養菌株は98%の類似度で同定された（クローン9 – AY945917.1 およびクローン46, 84 AY945905）。 Rhodocyclaceaeファミリーは、β-proteobacteriaに属するグラム陰性細菌である。 脱窒素を行う好気性桿菌であり、多様な代謝能力を有する。 ほとんどの種が水生環境と貧栄養土壌に生息している。 排水中にも多く存在し、そのような場所の生物学的除染処理に重要な役割を果たす(http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae)。 Liuら（2006）は、脱窒反応器に、染料、農薬、合成燃料の製造に使用される有害アミンであるキノリン（40 mg/L）、グルコース（180 mg/L）、硝酸塩、リン酸カリウム（C/N/Pが150：30：1）を供給した。 接種物はIndustry Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japan) の汚水処理システムの第2沈殿槽から採取したものです。 定常反応期間（6週間）後のキノリン除去率は90.2%であった。 植え付け材と脱窒反応器からの分子生物学的分析により、両試験で未培養の細菌、ThaueraとAzoarcusが検出された。 著者らによると、AzoarcusとThaueraに属する細菌に属するクローンの割合は、それぞれ脱窒リアクターで74%、接種物で4%であった。 環境試料から得られる微生物の知識は、純粋培養による実験室の条件に依存している（Pace, 1997）。 しかし、異なる生態系からの細菌の1％未満しか知られていない（Amann, 1995）、または約99％が研究され、同定されていない。 8761>

実験の分子生物学的解析でコンセンサスBacteriaドメインプライマーを用いて得られた系統樹を図4に示す。

異なる微生物群間の類似度係数は97%〜99%で、16S rRNA遺伝子部分評価配列から系統的に近縁種の存在が示唆された。 既知の種の配列はNCBIデータベースから、Aspergillus niger (FJ828924.1) をアウトグループの配列として用いた。

したがって、本研究で同定したAcidovorax、ComamonasおよびAcinetobacter種はVolkswagen São Carlos Motorsの活性汚泥システム内に存在し、硝酸還元とエタノール消費に関与していると思われた。

CONCLUSIONS

活性汚泥システムからの接種物の可能性と脱窒プロセスにおける炭素源としてのエタノールの使用は、バッチリアクタで実証された。

本研究で得られたMPN脱窒菌値は、硝酸塩の除去結果と合わせて、活性汚泥システムからの接種物には脱窒菌が存在し、それは与えられた栄養条件によって好適であることが明らかになった。 Acinetobacter sp.、Comamonas sp.および未培養菌が含まれていた。 8761>

ACKNOWLEDGMENTS

著者らはFAPESPとCNPqから受けた助成金を感謝する。

APHA, AWWA and WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22th Edition, American Public Health Association, Washington, DC (2005).

Iamamoto, C. Y., 高濃度アンモニア廃水を処理する浮遊バイオマス付シーケンシングバッチリアクタにおける窒素除去. 博士論文, ブラジル・サンパウロ大学工学部, サン・カルロス大学(2006).

Messing, J., New M13 vectors for cloning. メソッズ・イン・エンザイモロジー、101 20-78 (1983)。

Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere（微生物多様性と生物圏の分子論）. サイエンス, 276, 734-740 (1997).