Imunohistoquímica (IHC) é uma poderosa técnica baseada em microscopia para visualizar componentes celulares, por exemplo proteínas ou outras macromoléculas em amostras de tecidos. A força do IHC é a saída visual intuitiva que revela a existência e localização da proteína alvo no contexto de diferentes tipos celulares, estados biológicos e/ou localização subcelular dentro de tecidos complexos.
A técnica do IHC foi inventada durante os anos 40 (Coons, Creech, & Jones, 1941) e é usada rotineiramente como uma ferramenta importante nos cuidados de saúde e patologia para, por exemplo, fins diagnósticos ou para estratificar pacientes para regimes de tratamento otimizados. O IHC é também amplamente utilizado em pesquisas onde as moléculas de interesse são analisadas para estudar o seu papel tanto em células e tecidos saudáveis como doentes, a nível molecular, celular ou tecidual. Existem muitas maneiras diferentes de realizar a visualização de alvos nos tecidos usando métodos baseados no IHC ou IHC, e existem numerosos protocolos para diferentes aplicações e ensaios. Embora o IHC seja geralmente um método robusto e estabelecido, novos ensaios muitas vezes precisam de uma otimização cuidadosa, dependendo do tecido ou das propriedades da proteína alvo, da molécula aglutinante e/ou do sistema de comunicação. Muitos anos de desenvolvimento técnico e o enorme aumento da disponibilidade de moléculas aglutinantes específicas melhoraram muito a utilidade e as áreas de aplicação do IHC. O progresso no campo das técnicas e reagentes baseados no IHC tem permitido aos cientistas e prestadores de cuidados de saúde ferramentas, ensaios e biomarcadores mais precisos. Além disso, os avanços técnicos permitiram, por exemplo, a detecção simultânea altamente sensível de várias proteínas na mesma amostra e a detecção de interações proteína-proteína (ver Ensaio de Ligação de Proximidade).
O ensaio clássico de IHC é ilustrado na Figura 1 e envolve a detecção de epitopos expressos por um único alvo proteico dentro de uma amostra de tecido usando um “anticorpo primário” capaz de ligar esses epitopos com alta especificidade. Após o evento de ligação epitopo-anticorpo, é adicionado um “anticorpo secundário” capaz de ligar o anticorpo primário com alta especificidade. O anticorpo secundário é acoplado a uma molécula repórter e após o evento de ligação anticorpo-anticorpo, é adicionado um substrato químico que reage com a molécula repórter para produzir um precipitado colorido no local de todo o complexo epitopo-anticorpo.
Figure 1. O princípio básico da imuno-histoquímica.
Na ilustração esquemática (Figura 1) uma secção de tecido incrustado em parafina fixada em formalina é corada usando um anticorpo primário dirigido a um alvo proteico específico. Uma solução contendo o anticorpo primário é adicionada à secção do tecido e os anticorpos têm algum tempo para serem encontrados e ligados ao seu alvo. Após este passo, os anticorpos não ligados e excedentes são lavados e o anticorpo secundário é adicionado. O anticorpo secundário, que carrega uma molécula de ligação com enzimas de peroxidase de rábano silvestre (HRP), também tem algum tempo para se ligar ao anticorpo primário, seguido por outra etapa de lavagem. Depois disto, adiciona-se 3,3′ de Diaminobenzidina (DAB). A enzima HRP transforma o substrato de DAB em um precipitado marrom que é depositado no tecido no local da reação, produzindo assim uma representação visual de onde o anticorpo primário primeiro ligou seu alvo.
Tecnologia
Preparação do tecido
O tecido tem um papel central no experimento e é importante que ele seja processado para que epitopes e morfologia adequada sejam preservados. O processamento mais comum para o IHC é a preparação de blocos de tecido com fixação em parafina (FFPE). A finalidade da fixação de formalina é produzir ligações cruzadas químicas de proteínas dentro do tecido. Isto termina todos os processos celulares e congela os componentes celulares no local e na conformação em que se encontravam no momento da fixação e também previne a degradação. Após a fixação adequada, o tecido é processado e, por fim, incrustado em blocos de parafina, que são então seccionados em fatias finas (geralmente 4-10µm) usando um micrótomo. As seções são transferidas para lâminas de vidro e é permitido aderir antes do processamento posterior.
Outros métodos de fixação além da formalina são às vezes utilizados. Estes incluem outros tipos de aldeídos ou o uso de diferentes soluções alcoólicas. A melhor escolha de fixador depende muito do ensaio. Uma alternativa comum ao FFPE é a preparação de amostras de tecidos congelados. Neste caso, o tecido é embutido num meio crioprotector e congelado, e a fixação é feita após a secção. Tecidos congelados são seccionados em criostatos e têm a vantagem de tempos de processamento curtos e de melhor preservação de epitopos sensíveis, mas muitas vezes podem ser inferiores aos tecidos de FFPE em termos de preservação da morfologia histológica.
Recuperação de antígenos (epitopos)
Uma preocupação associada com fixadores de ligação cruzada como a formalina, ou tempo muito longo gasto em meio fixador é o mascaramento de epitopos, que pode obstruir a ligação do anticorpo primário ao seu alvo. Especialmente com amostras de FFPE, há frequentemente a necessidade de reverter algumas das reticulações químicas e “recuperar” os epitopos antes de prosseguir para o IHC real. Existem vários protocolos de recuperação de antigénios disponíveis e as principais estratégias incluem o tratamento da lâmina do tecido com calor, enzimas digestivas, detergentes, ou combinações destes. O método mais comum de recuperação de antígenos em amostras de FFPE é ferver sob pressão as lâminas teciduais em tampão ácido citrato durante cerca de 15-20 minutos.
Aglutinação de anticorpos
A qualidade e especificidade da molécula de ligação é crucial para qualquer técnica baseada em IHC, e a escolha do ligante pode afectar directamente o resultado, a fiabilidade e possivelmente também a interpretação do ensaio. Os anticorpos são de longe o tipo mais comum de molécula aglutinante usada para IHC, e embora a maioria dos anticorpos sejam capazes de detectar adequadamente a molécula de interesse correcta, eles também podem variar muito na sua especificidade para o seu alvo pretendido. Os anticorpos com elevada especificidade são, portanto, mais fiáveis na interpretação da ligação “on-target”, uma vez que produzem pouca ou nenhuma ligação “off-target” ou “background”. Anticorpos que são menos específicos podem produzir mais ligação “off-target”, e o fundo resultante irá possivelmente interferir com a interpretação correcta dos verdadeiros sinais “on-target”. Existem dois tipos principais de anticorpos; anticorpos policlonais que são uma mistura heterogénea de anticorpos que ligam diferentes epitopos no alvo e anticorpos monoclonais que ligam todos o mesmo epitopo. Os anticorpos policlonais são muitas vezes muito potentes devido à sua capacidade de detectar e ligar vários epitopos no mesmo alvo. No entanto, os epitopos que ligam são frequentemente mal definidos e com múltiplas e variadas especificidades de epitopos vem a maior probabilidade de eventos de ligação fora do alvo e ruído de fundo. No entanto, a potência dos anticorpos policlonais pode ser vantajosa, uma vez que a concentração de eventos de ligação em torno da molécula alvo geralmente compensa o potencial de ruído de fundo. Uma desvantagem é que os anticorpos policlonais são geralmente recursos limitados, uma vez que são derivados de soros animais. Os anticorpos monoclonais, pelo contrário, têm mais continuidade, uma vez que podem ser produzidos em linhas celulares de hibridoma. Os anticorpos monoclonais também são frequentemente bem definidos em termos de ligação epitopular, mas ainda podem gerar resultados difíceis de interpretar se a especificidade for baixa ou se o epitopo-alvo estiver presente em baixa abundância.
É necessária uma cuidadosa optimização e titulação da concentração de anticorpos para cada ensaio, uma vez que o resultado depende não só da especificidade e afinidade do anticorpo para o alvo, mas também da concentração e disponibilidade de epitopos on-target e potenciais off-target presentes na amostra. A adição de demasiados anticorpos à amostra irá aumentar o número de possíveis eventos de ligação de baixa afinidade fora do alvo assim que os epitopos on-target estiverem saturados com aglutinantes. Ao baixar a concentração de anticorpos, os eventos de ligação fora do alvo tornam-se mais raros, pois normalmente têm menor afinidade do que os eventos de ligação dentro do alvo. O risco quando se tenta reduzir o fundo enquanto se usa um anticorpo de baixa afinidade é que os sinais on-target são concomitantemente enfraquecidos ao ponto de fornecer um resultado falso negativo.
Outros tipos de moléculas aglutinantes por vezes utilizados em técnicas baseadas em IHC incluem afibodies, peptides, fragmentos de anticorpos ou outras moléculas pequenas.
Sistemas de detecção
O objectivo de realizar IHC é obter uma representação visual de onde o alvo pode ser encontrado dentro do tecido experimental, e de preferência também obter informação sobre o padrão de expressão do alvo entre populações celulares heterogéneas e/ou localizações subcelulares. Isto é exemplificado na Figura 2, que ilustra como diferentes anticorpos são usados para visualizar diferentes compartimentos celulares ou teciduais dentro de um tecido complexo. Para visualizar a interação alvo-anticorpo, é necessário algum tipo de sistema de detecção que produza uma mancha ou sinal observável. O método mais comum para introduzir um sistema de detecção no experimento é usar um anticorpo secundário que carrega uma molécula de repórter pré-imposto, ou seja, uma enzima ou fluoróforo. Os anticorpos secundários são geralmente dirigidos especificamente para moléculas de anticorpos de uma espécie animal diferente. Por exemplo, se o anticorpo primário é criado em um coelho, então o anticorpo secundário deve ser criado em outro animal e direcionado especificamente para os anticorpos de coelhos.
| Esofago | Magnificação | |||
|---|---|---|---|---|
| Hematoxylin corante | Sem coloração de anticorpos | |||
| TP63 CAB000083 |
Coloração nuclear | |||
| EGFR CAB000035 |
Membranosa coloração | |||
| G6PD HPA000247 |
Coloração citoplasmática | |||
| LAMB2 (Lamininin) CAB000053 |
Tecido conjuntivo |
Figure 2. Visualização de diferentes alvos proteicos em tecidos complexos. A coluna da direita mostra uma ampliação das imagens correspondentes na coluna da esquerda.
Na imagem do IHC (Figura 2), secções consecutivas do esófago humano coradas com quatro anticorpos diferentes permitem a comparação directa de diferentes padrões de expressão de proteínas dentro do tecido e dentro dos compartimentos subcelulares. As imagens de topo são apenas contra-manchas para hematoxilina para comparação. A p63 cora os núcleos celulares de anticorpos em uma população de células que residem na parte basal do epitélio do esôfago. O anticorpo EGFR (Epidermal growth factor receptor) parece corar a mesma população celular que o p63, mas mancha as membranas celulares em vez dos núcleos. O anticorpo G6PD (Glucose-6-fosfato desidrogenase) cora o citoplasma de um repertório mais amplo de células epiteliais do esôfago e também células residentes no tecido conjuntivo. O anticorpo Lamininin (LAMB2) cora apenas células e estruturas no tecido conjuntivo subjacente ao esófago.
Para amostras de tecido FFPE o método de detecção mais comum é o uso de reacções enzimáticas para gerar um precipitado colorido no local de ligação de anticorpos. Os anticorpos secundários transportam então uma enzima, por exemplo, peroxidase de rábano (HRP) ou fosfatase alcalina (AP), que são capazes de converter cromogéneos como 3,3′ Diaminobenzidina (DAB) ou 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/ cloreto de p-nitroblue tetrazólio (BCIP/NBT) em precipitados castanhos ou azuis que são depositados no tecido no local da reacção. As manchas cromogênicas são observáveis na microscopia da luz e são geralmente muito estáveis durante longos períodos de tempo, o que é benéfico se o experimento precisar ser arquivado ou revisado posteriormente.
Para seções congeladas do tecido é mais comum o uso de anticorpos secundários ligados ao fluoróforo que emitem uma cor específica (geralmente verde, vermelho ou azul) quando excitados pelos comprimentos de onda de luz corretos. Além disso, os fluoróforos geralmente não são estáveis por longos períodos de tempo. Entretanto, o benefício do uso de fluoróforos é que eles fornecem um método fácil para realizar experimentos de dupla etiquetagem onde vários anticorpos para múltiplos alvos são testados na mesma amostra. Os anticorpos secundários precisam ser direcionados para diferentes anticorpos primários e também para serem acoplados a diferentes fluoróforos. Os diferentes anticorpos secundários são então observados separadamente, excitando-os sequencialmente com diferentes comprimentos de onda de luz. Estes diferentes resultados de excitação são salvos como imagens separadas (ou canais de cor) e podem mais tarde ser sobrepostos para inferir co-localizações de proteínas, etc.
Utilizar anticorpos secundários para detecção é em si um passo de amplificação, uma vez que vários anticorpos secundários são capazes de ligar um único anticorpo primário, mas às vezes são desejados mais passos de amplificação para aumentar o sinal e a sensibilidade da experiência. Nesses casos, o anticorpo secundário pode, em vez disso, carregar “moléculas de ligação”, por exemplo, polímeros de biotina, que são capazes de recrutar um maior número de moléculas de repórter nos passos subsequentes. Esta estratégia de amplificação de sinais é útil tanto para métodos de detecção enzimática quanto fluorescente.
Contaminação
A coloração imunohistoquímica usando cromógenos frequentemente se beneficia da aplicação de uma contra-mancha que melhora o contraste e facilita a observação de características histológicas. O tipo de contra-mancha mais comum usado para amostras de FFPE é a hematoxilina que cora o citoplasma celular com uma cor azulada pálida, e mancha os núcleos celulares com uma nuance azulada mais escura. As colorações fluorescentes geralmente não são contra-manchadas com hematoxilina, uma vez que o método de detecção não é baseado em microscopia de luz. Em vez disso, a maneira mais comum de obter coloração de contraste para fluorescência é rotular os núcleos celulares adicionando corantes fluorescentes que ligam os ácidos nucléicos. Após a reação imunohistoquímica real, os únicos passos restantes são cobrir e selar a amostra para proteção e armazenamento de longo prazo. A forma mais comum é “colar” a lamela à amostra usando resinas comercialmente disponíveis para o efeito.
Exemplos específicos
IHC é amplamente utilizado tanto na pesquisa como na prática clínica. O projeto do Atlas de Proteínas Humanas (HPA) é um excelente exemplo de como o IHC de alto rendimento é usado para obter um mapeamento em larga escala do proteoma humano em uma multiplicidade de tecidos, cânceres e células. No projeto HPA, uma cadeia de produção interna de anticorpos em larga escala simplificada facilita a geração de anticorpos específicos, que após passar por regimes básicos de caracterização e validação, são usados para sistematicamente colorir microarrays de tecido contendo centenas de núcleos de tecido dentro de um único experimento. O sistema para IHC empregado pelo HPA baseia-se fortemente na padronização de protocolos e automatização usando máquinas, mas a avaliação da titulação ótima para cada anticorpo é realizada manualmente antes que o anticorpo seja aprovado para coloração em todo o conjunto de tecidos. Cada núcleo de tecido corado é anotado com respeito à coloração imunohistoquímica em tecidos e tipos celulares, e posteriormente publicado como uma imagem de alta resolução no portal web para ser livremente visualizado por qualquer pessoa.
Na prática clínica, o IHC é usado principalmente na patologia para ajudar os médicos a avaliar amostras de tecidos com respeito a estados saudáveis e ou doentes, para estabelecer diagnósticos e para definir o subtipo molecular de diferentes tipos de câncer. Um exemplo específico onde o IHC é usado no diagnóstico é quando os patologistas são apresentados com uma amostra de tumor metastático e a origem tecidual do tumor primário é desconhecida. Nestes casos, os patologistas utilizam um painel de diferentes anticorpos que visam proteínas específicas do tecido, como o antigénio específico da próstata para o cancro da próstata, ou o receptor de estrogénio para os cancros ginecológicos, ou a citoqueratina 20 para os cancros gastrointestinais (Gremel et al., 2014). Uma vez feita uma classificação ampla, anticorpos adicionais específicos do tecido são utilizados para identificar melhor a origem do tumor primário. Esta informação é útil para escolher a melhor ou mais apropriada estratégia para terapia medicamentosa e/ou para localizar o tumor primário para radioterapia e/ou cirurgia.
Referências e Links
Anticorpos comumente usados para diagnóstico de câncer:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopatologia. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
Uma revisão sobre validação de anticorpos para IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: uma avaliação crítica das estratégias usadas para validação de biomarcadores imunohistoquímicos. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – Uma base de dados de acesso aberto de anticorpos disponíveis publicamente e sua utilidade em várias aplicações:
IHC mundo – Protocolos, Fórum, Produtos, e mais:
Um clipe do YouTube ilustrando IHC de BioGenexLaboratories: