Immunoassay Screening of Diphenhydramine (Benadryl®) in Urine and Blood Usando um ensaio recentemente desenvolvido

Abstract

Difenidramina (DPH) é um anti-histamínico comum, que produz sonolência e tem o potencial de causar condução sob a influência de drogas…acidentes relacionados. Até à data não existem kits de imunoensaio disponíveis comercialmente para a sua detecção em fluidos biológicos como a urina e/ou o sangue. Descrevemos um novo teste de imunoensaio enzimático (ELISA) e relatamos a sua utilidade na análise de espécimes autênticos obtidos de voluntários. O ensaio é específico para a detecção de DPH e não detecta anti-histamínicos estreitamente relacionados como a bromefeniramina, a clorfeniramina e a doxilamina. Existe uma quantidade variável de reactividade cruzada observada com certos compostos tricíclicos, devido a semelhanças na estrutura da cadeia lateral com a DPH. A precisão intra- e inter-dia do ensaio foi determinada como sendo inferior a 10%. O ensaio é altamente sensível e tem uma faixa de trabalho de 1 a 500 ng/mL para urina e 1 a 250 ng/mL para sangue. O ensaio foi ainda validado com amostras autênticas de urina e sangue obtidas de voluntários e laboratórios do médico legista.

Introdução

Difenidramina (DPH), 2-difenilmetoxi-N,N-dimetilethanamine, é um anti-histamínico à base de etanolamina. Foi um dos primeiros agentes anti-histamínicos descobertos em 1946 e é amplamente tomado para o alívio dos sintomas comuns de alergia. O DPH exerce sua ação bloqueando os efeitos da histamina nos locais receptores de H1 e é também um inibidor de CYP2D6 e depressor do sistema nervoso central (SNC). Além de ser um anti-histamínico, também é usado como antiemético, antitussivo e sedativo. Embora eficaz, o DPH tem vários efeitos colaterais que incluem sonolência, comprometimento motor, batimentos cardíacos rápidos, visão embaçada, e outros (1, 2), por isso tem sido relatado como um fator de risco em situações de condução perigosa (3-5). As interações do DPH com outros medicamentos e/ou álcool podem aumentar ainda mais o risco de acidentes e fatalidades relacionados à direção.

Anti-histamínicos são amplamente classificados em anti-histamínicos de primeira geração, segunda geração e prescrição. Os anti-histamínicos de primeira geração, que incluem o DPH (Benadryl™), estão todos disponíveis no balcão e causam sonolência acentuada. Os anti-histamínicos relacionados nesta classe são a clorfeniramina (Singlet™), a brompheniramina (Dimetapp™) e a doxilamina (Vicks NyQuil™). Outro anti-histamínico de primeira geração é o sal 8-clorotefilinato de DPH, conhecido como dimenidrinato (Dramamine™), que é prescrito para o enjoo do movimento. Os anti-histamínicos de segunda geração incluem loratadina (Claritin™), desloratadina (Clarinex™), acrivastina (Semprex-D™), ebastina (Kestine™), cetirizina (Zyrtec™) e fexofenadina (Allegra™), que são alternativas não sonolentas à DPH. A Figura 1 mostra as estruturas químicas dos anti-histamínicos comumente encontrados.

Os efeitos indutores do sono do DPH resultaram na sua combinação com outros medicamentos como o acetaminofeno, em formulações como o Tylenol PM™, ou com descongestionantes nasais como a pseudoefedrina. Embora o DPH seja um dos anti-histamínicos mais antigos, está facilmente disponível no balcão e é mais eficaz e de acção mais rápida do que alguns dos medicamentos mais recentes, daí o seu uso generalizado (6). O rótulo de aviso no Benadryl indica claramente o perigo de conduzir depois de tomar o medicamento. Além disso, numerosos estudos comprovaram claramente o comprometimento das capacidades motoras e do desempenho cognitivo associado à complexa tarefa de operar automóveis após a ingestão de DPH versus uma segunda geração de anti-histamínicos ou mesmo de álcool (7-12). Também tem havido um estudo sobre o aumento do risco de lesão após a toma de DPH em comparação com a segunda geração de anti-histamínicos (13). Esses estudos racionalizariam claramente a importância do teste principalmente para DPH.

DPH está disponível em várias formas de dosagem, incluindo líquido, comprimidos, cápsulas, gomas de mascar, e cremes tópicos. A dose sugerida para adultos está na faixa de 25-50 mg a cada 4-6 h, não excedendo 50-100 mg (1). Quando o DPH é tomado, é rapidamente absorvido pelo organismo, com uma actividade máxima observada cerca de 1 h após a toma do medicamento. A meia-vida do DPH é de cerca de 2-9 h, sendo o pico de concentração plasmática atingido após cerca de 1-4 h após a toma da dose. Após uma dose oral única de 50 mg, foram detectados picos médios de concentração plasmática de 83 ng/mL de difenidramina após 3 h, que depois diminuíram para 9 ng/mL em 24 h (14). Uma dose oral única de 100 mg de DPH resultou em concentrações médias de pico de plasma de 112 ng/mL a 2 h após a dose (15). A eficácia dos anti-histamínicos é observada em concentrações superiores a 25 ng/mL, sonolência pode ser observada em 30-40 ng/mL, e deficiência mental observada com concentrações acima de 60 ng/mL (16). Tem sido relatado que os níveis terapêuticos de DPH na faixa sanguínea entre 25 e 112 ng/mL, os níveis tóxicos são cerca de 5000 ng/mL, e os níveis letais são em qualquer lugar acima de 8000 ng/mL (3, 17). Também houve vários casos de abuso de DPH que foram documentados durante muitos anos (18-20).

O metabolismo in vivo de DPH resulta em cerca de 30% da dose sendo convertida para o metabolito N-desmetil, seguido pela formação do metabolito N,N-didesmetil e 13% da dose convertida para metabólitos acetila através da amina. Uma pequena porcentagem é convertida em ácido difenilmetoxiacético, e a porcentagem maior remanescente da dose é excretada inalterada como a droga mãe (21, 22). O metabolismo da difenidramina está delineado na Figura 2.

Métodos tradicionais de teste de DPH em plasma humano envolveram extração de amostras caras e demoradas, seguidas de procedimentos de confirmação. Vários grupos têm relatado o uso de vários métodos cromatográficos de gás (GC) para detecção de DPH no plasma e na urina (23-27). Também houve relatos de eletroforese capilar (28) e métodos de cromatografia líquida espectrometria de massa (LC-MS) (29) que foram desenvolvidos para a detecção de DPH. Até o momento, não há relatos na literatura sobre triagem para difenidramina usando ELISA ou qualquer outro método de imunoensaio. Nesta publicação, relatamos o primeiro método de triagem ELISA para DPH em urina e sangue humanos.

É considerada prática padrão nos laboratórios de toxicologia realizar uma triagem de imunoensaio, onde amostras positivas são primeiramente identificadas e posteriormente confirmadas pelas técnicas GC-MS ou LC-MS. Isto é empregado como uma estratégia de “custo-benefício” pela maioria dos laboratórios de toxicologia, em oposição a realizar um procedimento de confirmação mais caro em cada amostra recebida. Assim, seria útil um método de triagem ELISA confiável para aplicação em amostras de DPH relacionadas a acidentes de direção e fatalidades. Para este objetivo, os toxicólogos apresentaram recomendações para o DUID, incluindo um corte proposto de DPH de 25 ng/mL no sangue e 50 ng/mL na urina (30). Este artigo descreve um método robusto e preciso de triagem ELISA para DPH em urina e sangue humano seguindo estas diretrizes propostas.

Experimental

Materiais

Reagentes e produtos químicos. A difenidramina foi obtida de Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), e a difenidramina -d3 (100 μg/mL solução em metanol) foi obtida de Cerilliant (Round Rock, TX). O anticorpo policlonal específico DPH foi levantado por Immunalysis (Pomona, CA), e os conjugados marcados com DPH e peroxidase de rábano foram sintetizados em Immunalysis. O reagente de substrato 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) utilizada para a reação colorimétrica foi obtido de Pierce (Rockford, IL). As enzimas utilizadas no processo foram a tiroglobulina bovina (BTG) obtida de Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), a peroxidase de rábano rábano (HRP) obtida de Enzimas BBI (Madison, WI) e a albumina de soro bovino (BSA) obtida de Proliant Biologicals (Boone, IA). Todos os solventes utilizados foram de grau HPLC, e todos os químicos foram de grau ACS e obtidos de Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Para ELISA, os calibradores elevados para DPH a 1000 ng/mL foram preparados em urina e sangue sintético negativo e armazenados a 4°C. A urina sintética negativa e o sangue sintético negativo usados neste ensaio foram formulados com ingredientes encontrados nessas respectivas matrizes e corresponderam às respostas do imunoensaio de três amostras negativas de urina humana e sangue (31, 32). A urina sintética negativa consiste em uma solução de BSA 0,1% em água desionizada; com corante amarelo 0,2% FD&C #6, e o sangue sintético negativo consiste em uma formulação patenteada de imunólise.

Apparatus. As colunas de afinidade HiTrap proteína G HP que foram usadas para purificação da imunoglobulina G (IgG) foram compradas da GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Placas de microtitulação padrão de poliestireno (poço 96) foram obtidas de Corning Costar (Corning, NY). Uma lavadora de microplacas Tecan Columbus Pro e um leitor de placas Tecan Sunrise foram ambos obtidos da Tecan (San Jose, CA). As pipetas que foram usadas durante o processo de desenvolvimento do imunoensaio foram todas obtidas da Rainin Instruments (Oakland, CA). A 6410 triplo-quadrupole MS e a coluna Zorbax Eclipse XDB C18 utilizada para análise LC-MS-MS foram ambas adquiridas da Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Métodos

ELISA. A etapa primária no desenvolvimento do método ELISA envolveu a geração de anticorpos policlonais baseados na resposta imunoquímica de uma espécie animal selecionada a um antígeno específico de DPH. Para este objetivo, os coelhos foram primeiramente imunizados com um antígeno DPH constituído de DPH conjugado à tiroglobulina bovina (BTG). O processo de imunização e sangramento dos coelhos foi contratado a uma instalação especializada em animais. O soro obtido dos coelhos foi purificado internamente por cromatografia de afinidade por eluição através de colunas de proteína G, a fim de se obter a fração de IgG purificada. A IgG policlonal específica DPH foi então imobilizada em placas de microtitulação de poliestireno de 96 poços. O excesso de anticorpos foi aspirado, os locais de ligação de anticorpos livres foram bloqueados com uma solução de trealose a 1% em água e as placas foram então secas em uma estufa de vácuo a 37°C durante a noite. As placas foram ainda armazenadas em uma bolsa selada com dessecante, pois é fundamental para mantê-las livres de umidade. Uma curva de dose-resposta de urina DPH foi preparada pela primeira vez fortificando urina sintética negativa a 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 e 500 ng/mL da solução de reserva de alto calibrador da droga. A curva de sangue foi obtida fortificando sangue sintético negativo a 1, 5, 10, 25, 50, 100, e 250 ng/mL a partir da solução de alto calibrador. Estes calibradores no sangue sintético foram então diluídos 1:10 com tampão fosfato 100 mM contendo 150 mM de cloreto de sódio (tampão fosfato salino, pH 7,0) antes da análise. Todas as amostras de sangue foram igualmente diluídas 1:10 com solução tampão fosfato salina (pH 7,0). As amostras de urina também foram diluídas 1:20 com solução tampão fosfato salina de 100 mM (pH 7.0). Os calibradores e as amostras foram então pipetados em duplicado para os poços da placa de microtitulação, usando um tamanho de amostra de 10-μL tanto para a urina como para o sangue. Seguiu-se a adição de 100 μL de conjugado enzimático constituído por difenidramina rotulada com HRP. A placa foi então autorizada a incubar durante 1 h no escuro, à temperatura ambiente. Em seguida, os poços foram lavados seis vezes com 350 μL de água desionizada utilizando uma lavadora de placas de microtitulação, aspirada para remover a água, depois invertida e seca para remover qualquer água residual dos poços. O substrato cromogênico TMB (100 μL) foi então adicionado a cada poço e a placa incubada por mais 30 min no escuro. A reacção foi então interrompida com 100 μL de ácido clorídrico 1 N, para produzir uma cor amarela. O ensaio é colorimétrico e a absorvância foi lida a um comprimento de onda duplo de 450 nm e 650 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação. O comprimento de onda de 650 nm mede a absorvância de fundo, que o leitor de placas subtrai então da absorvância final. A intensidade da cor produzida é inversamente proporcional à concentração do analito na amostra.

LC-MS-MS. Para a análise foi utilizada uma bomba LC série 1200 acoplada a uma MS de 6410 triplo-quadrupole que opera em modo de ionização positiva por electrospray (ESI). A coluna LC-MS-MS utilizada foi uma Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). A amostra para análise foi preparada da seguinte forma: uma amostra de 100 µL de urina contendo 50 µL de difenidramina -d3 (200 ng/mL) foi adicionada a um frasco de auto-amplificador. As amostras foram injetadas diretamente no LC-MS-MS através de um autoinjetor. A temperatura da coluna foi mantida a 60°C, e o volume de injeção foi de 5 µL. A fase móvel consistiu de ácido acético 0,2% pH 4 (solvente A) e metanol (solvente B). Inicialmente, a composição da fase móvel era 100% A a uma vazão de 0,7 mL/min durante um período de 6 min, depois a porcentagem de metanol foi aumentada para 100%, retornando novamente para 100% A após 7 min.

A temperatura do gás era de 350°C, o fluxo de gás era de 10 L/min, e a pressão do nebulizador foi mantida a 50 psi. O nitrogênio foi utilizado como gás de colisão, e a tensão capilar foi de 4000V. Duas transições foram selecionadas e otimizadas para cada droga. O tempo de permanência foi de 50 ms, e a energia ótima do fragmentador foi de 80V para todas as transições. As tensões da energia ótima de colisão foram determinadas como sendo 35V para o padrão interno deuterado (difenidramina -d3), 15V para a transição primária e 30V para a transição secundária para a própria difenidramina. A razão entre a transição do qualificador e a transição do quantificador foi determinada em aproximadamente o ponto médio da faixa de calibração: 100 ng/mL. A transição para difenidramina -d3 foi 259,7 > 165,2; a transição primária (quantificadora) para difenidramina foi 256,7 > 167,2; transição qualificadora (secundária) foi 256,7 > 152,2. A difenidramina não rotulada pode se decompor em íons de produto de m/z 167 ou 165 do íon precursor, dependendo da energia de colisão aplicada. O nosso procedimento foi validado utilizando as condições descritas. O limite de detecção (LOD) do método LC-MS-MS foi de 10 ng/mL e foi determinado como sendo a concentração mais baixa detectável com uma relação sinal/ruído > 2.

Resultados e Discussão

Curva de resposta de dose

O método utiliza ligação competitiva entre o conjugado enzimático e o analito livre na amostra para uma quantidade fixa de sítios de ligação de anticorpos, proporcional à sua concentração na mistura. As curvas de dose-resposta para DPH foram preparadas em urina sintética negativa e sangue sintético negativo nas concentrações descritas anteriormente. B0 é a absorvância do calibrador negativo, e B representa a absorvância dos níveis individuais do calibrador. A relação percentual do calibrador individual para o calibrador negativo (B/B0) foi calculada para cada nível de calibrador e traçada em relação à concentração da droga (ng/mL) tanto para a urina como para o sangue (Figura 3). Os valores de B/B0 são inversamente proporcionais à concentração do fármaco na amostra, sendo que quanto maior a concentração do fármaco, menos a enzima conjugada se liga ao anticorpo, produzindo assim um menor valor de absorvância.

LOD e corte

O LOD do ensaio DPH foi determinado como a concentração mais baixa que pode ser medida com precisão usando os parâmetros descritos para o ensaio. Três amostras autênticas de urina sem drogas foram fortificadas com concentrações variáveis de DPH até 1 ng/mL e depois analisadas em duplicado. O valor mais baixo calculado a partir de dois desvios padrão foi obtido e com base neste resultado o LOD para o ensaio foi determinado como sendo de 1 ng/mL. As concentrações de corte foram projetadas para ser 50 ng/mL para a urina e 25 ng/mL para o sangue. Ambos foram estabelecidos como os pontos ideais de decisão baseados em dois desvios padrão de calibradores na parte linear da curva dose-resposta, bem como tendo em mente as diretrizes recomendadas estabelecidas pelo campo toxicológico.

Selectividade

Interferência de compostos relacionados e não relacionados foi estudada através do pico dessas substâncias em urina sintética negativa e a sua execução no ensaio ELISA. A Tabela I mostra os dados de reactividade cruzada com os compostos estreitamente relacionados em estrutura e actividade farmacológica com a difenidramina, que foram encontrados a 1% ou menos no corte do ensaio de 50 ng/mL. A orfenadrina, que é um relaxante muscular, bem como um agente anti-histamínico, reagiu de forma cruzada com o ensaio a 42% porque tem uma estrutura muito semelhante à da DPH, embora seja um grupo substituto do metilo. Nenhum dos metabólitos do DPH mostrado na Figura 2 foi rastreado como reativo cruzado neste ensaio porque não estava comercialmente disponível na época.

Compostos que não estavam relacionados com DPH também foram analisados em concentrações de 100.000 ng/mL no ensaio. A Tabela II mostra a reactividade cruzada com estes compostos não relacionados. A maioria desses compostos não interferiu com a detecção do DPH no ensaio. Devido às semelhanças na estrutura da cadeia lateral, vários compostos como amitriptilina, clorpromazina, clomipramina, doxepina, imipramina e ciclobenzaprina apresentaram graus variáveis de reatividade cruzada com o ensaio. Os métodos de confirmação excluiriam de preferência quaisquer falsos positivos detectados pelo ELISA como resultado destes reativos cruzados que pudessem interferir com o ensaio DPH. Foram também estudados os efeitos de matriz de amostras autênticas de urina e sangue sem DPH para determinar os seus efeitos no ensaio. Não foram observados resultados falsos-positivos indesejáveis devido às matrizes de urina e sangue quando amostras de urina e sangue sem DPH confirmadas pelo LC-MS-MS foram rastreadas com o ensaio.

Precisão

Elisa intraday e interday precisões foram realizadas apenas na urina sintética em concentrações de 0, 5, 10, 25, e 50 ng/mL. A precisão intradiária foi calculada como coeficiente de variação (CV%) a partir de 8 análises realizadas no mesmo dia (n = 8) e foi inferior a 10%, e a precisão inter-dia (CV%) foi calculada a partir de 8 análises por dia durante 10 dias (n = 80) e também foi encontrada inferior a 10%. Os dados são mostrados na Tabela III.

Estabilidade e validade do ensaio

A validade de um produto pode ser definida como o tempo em que as características essenciais de desempenho são mantidas sob condições específicas de manuseio (33). A fim de atender a essa exigência de reagentes clínicos, foi realizado um estudo de teste de estabilidade acelerado para determinar o prazo de validade aproximado do produto comercial. O conjugado enzimático DPH-HRP foi enfatizado a 37°C por um período de 14 dias e durante esse tempo foi testado em intervalos e seu desempenho comparado com o conjugado enzimático refrigerado armazenado a 4°C. A curva dose-resposta foi executada em níveis de calibração de 10, 50 e 100 ng/mL em urina sintética durante o período de 14 dias. O ensaio mostrou uma dose-resposta quase idêntica durante todo o estudo de tempo acelerado de 2 semanas. Este período de 14 dias de teste de tempo acelerado representa o equivalente a pelo menos 18 meses de estabilidade em tempo real a 4°C (33). Os dados são mostrados na Figura 4.

Exemplos autênticos

Para validar o ensaio, os espécimes de urina foram obtidos em diferentes momentos ao longo de um período de uma semana, de cinco voluntários que são usuários terapêuticos regulares de difenidramina, devido aos sintomas comuns de alergia. Todos os cinco voluntários foram solicitados a preencher um questionário indicando todos os medicamentos que estavam tomando, e foi notado que nenhum outro medicamento foi listado. Vinte espécimes foram coletados e primeiro analisados por ELISA e depois confirmados usando LC-MS-MS. Todas as amostras de urina foram pré-diluídas 1:20 com 100 mM de solução tampão fosfato salina (pH 7,0) antes da realização do ELISA. Seis amostras foram consideradas negativas por ambos os métodos, enquanto 14 amostras foram positivas pelo ELISA, das quais 1 amostra foi confirmada como sendo negativa pelo LC-MS-MS. Isto pode ser porque a quantidade de DPH presente nessa amostra, tal como encontrada pelo LC-MS-MS, estava próxima do corte de 50 ng/mL. As amostras positivas de urina foram encontradas contendo DPH entre os níveis de 60 e 700 ng/mL. Dez amostras de urina de controle também foram preparadas fortificando urina sintética negativa com baixas e altas concentrações positivas de difenidramina e analisadas posteriormente no ensaio. Os resultados foram todos positivos pelo ELISA e correlacionados com seus dados de confirmação LC-MS-MS.

Amostras post-mortem foram utilizadas para validação do ensaio de sangue. Vinte amostras de sangue post-mortem foram obtidas no laboratório do LA County Coroner. Todas as amostras de sangue foram pré-diluídas 1:10 com 100 mM de solução tampão fosfato salina (pH 7,0) antes da análise. Todas as 20 amostras testadas positivas pelo ELISA e foram comparadas com os seus dados de confirmação GC-MS, também fornecidos pelo laboratório do médico-legista, que as mostrou contendo uma ampla gama de concentrações de DPH entre < 100 e 870 ng/mL. Embora uma amostra tenha confirmado menos do que o limite de quantificação de GC-MS de 100 ng/mL, a DPH ainda foi identificada usando o procedimento ELISA. O objetivo deste estudo foi validar o método ELISA com um procedimento de confirmação conhecido e não tentar a interpretação das concentrações. A conclusão deste estudo é que o ensaio ELISA é capaz de detectar níveis terapêuticos de HPP, bem como níveis pós-morte muito mais elevados, podendo, portanto, ser facilmente utilizado para fins de rastreamento por DUID, bem como casos de fatalidade.

Conclusões

DPH é um medicamento de venda livre que tem sido associado a inúmeros acidentes relacionados à condução, bem como fatalidades. Portanto, uma tela ELISA seria útil para determinar a presença de medicamentos de venda livre, como anti-histamínicos, em amostras obtidas através de situações relacionadas com a condução. Este artigo descreve o desenvolvimento de um método de rastreio ELISA altamente sensível e específico para a difenidramina, tanto na urina como nas matrizes sanguíneas, com precisão <10%. Tanto quanto é do conhecimento dos autores, este é o primeiro método de imunoensaio desenvolvido para a detecção de DPH em fluidos do corpo humano. Este método segue as diretrizes recomendadas para um corte de 50 ng/mL na urina e 25 ng/mL no sangue para casos de DUID. A validade do método também foi verificada com amostras autênticas de urina e sangue, e os dados ELISA correlacionados com os resultados de confirmação LC-MS-MS e GC-MS. Apesar de algumas das amostras analisadas serem de casos pós-morte, os resultados obtidos a partir delas combinados com a baixa DBO do ensaio demonstram claramente a aplicabilidade do ensaio a casos de deficiência na estrada, onde podem ser detectadas quantidades inferiores de DPH. Observou-se algum grau de reatividade cruzada com determinados compostos tricíclicos que são estruturalmente similares ao DPH; entretanto, quaisquer falsos positivos resultantes de tais compostos seriam eliminados na fase de confirmação. Outros estudos precisam ser realizados para eliminar os problemas de reatividade cruzada com os compostos tricíclicos e melhorar a de anti-histamínicos similares.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por financiamento da Immunalysis Corporation. Gostaríamos de agradecer ao Dr. James Soares e ao Sr. Michael Vincent pelas discussões aprofundadas durante a preparação deste manuscrito, à Sra. Cynthia Coulter pela análise LC-MS-MS de amostras de urina, e ao Sr. Dan Anderson no laboratório do LA County Coroner pelo fornecimento de amostras de sangue positivas. Também queremos agradecer a todos os voluntários que forneceram amostras de urina.