Gertrude Stein nasceu em Allegheny, Pennsylvania, a 3 de Fevereiro de 1874, para imigrantes judeus-alemães ricos. Aos três anos, sua família mudou-se primeiro para Viena e depois para Paris. Eles voltaram para a América em 1878 e se estabeleceram em Oakland, Califórnia. Sua mãe, Amelia, morreu de câncer em 1888 e seu pai, Daniel, morreu em 1891.
Stein freqüentou o Radcliffe College de 1893 a 1897, onde se especializou em Psicologia sob a orientação do notável psicólogo William James. Após deixar Radcliffe, ela se matriculou na Universidade Johns Hopkins, onde estudou medicina por quatro anos, saindo em 1901. Stein não recebeu um diploma formal de nenhuma das instituições.
Em 1903, Stein mudou-se para Paris com Alice B. Toklas, uma amiga mais jovem de São Francisco que permaneceria sua parceira e secretária durante toda a sua vida. O casal não voltou para os Estados Unidos por mais de trinta anos. Durante a Primeira Guerra Mundial, eles foram voluntários juntos, conduzindo suprimentos para hospitais na França.
No convívio com Toklas e seu irmão Leo, um crítico de arte e pintor, Stein ficou com um apartamento na margem esquerda. Sua casa, 27 rue de Fleurus, logo se tornou lugar de encontro para muitos jovens artistas e escritores, incluindo Henri Matisse, Ezra Pound, Pablo Picasso, Max Jacob e Guillaume Apollinaire.
A artista era uma apaixonada defensora do “novo” na arte, suas amizades literárias cresceram para incluir escritores tão diversos quanto William Carlos Williams, Djuana Barnes, F. Scott Fitzgerald, James Joyce e Ernest Hemingway. Foi para Hemingway que Stein cunhou a frase “a geração perdida” para descrever os escritores expatriados que viviam no estrangeiro entre as guerras.
Até 1913, o apoio de Stein aos pintores cubistas e sua escrita cada vez mais vanguardista causou uma cisão com seu irmão Leo, que se mudou para Florença. O seu primeiro livro, Três Vidas, foi publicado em 1909. Ela o seguiu com Tender Buttons (Claire Marie) em 1914. Tender Buttons mostrou claramente o profundo efeito que a pintura moderna teve em sua escrita. Nesses pequenos poemas em prosa, imagens e frases se unem de formas muitas vezes surpreendentes – semelhantes à pintura cubista. Sua escrita, caracterizada pelo uso de palavras para suas associações e sons ao invés de seus significados, recebeu considerável interesse de outros artistas e escritores, mas não encontrou um grande público.
As obras mais influentes de Among Stein são The Making of Americans (1925); How to Write (1931); The Autobiography of Alice B. Toklas (1933), que foi um best-seller; e Stanzas in Meditation and Other Poems (1956). Sherwood Anderson na introdução a Geografia e Peças (1922) escreveu que sua escrita “consiste em uma reconstrução, e toda uma nova reformulação da vida, na cidade das palavras”
Stein morreu no Hospital Americano de Neuilly em 27 de julho de 1946, de câncer inoperável.