00:00:07.25Hi meu nome é Jennifer Doudna da UC Berkeley
00:00:09.26 e estou aqui hoje para contar como descobrimos
00:00:12.26a nova tecnologia de engenharia de genoma.
00:00:15.07 Esta história começa com um sistema imunológico bacteriano
00:00:20.12 que significa entender como as bactérias
00:00:22.14 combatem uma infecção viral.
00:00:24.26 Acontece que muitas bactérias
00:00:28.04 têm em seu cromossomo,
00:00:30.09 que é o que você está olhando aqui
00:00:32.15a seqüência de repetições mostradas nestes diamantes negros
00:00:36.18a são intercaladas com seqüências
00:00:40.19that são derivados de vírus
00:00:43.08 e estes foram notados por microbiologistas
00:00:46.20que estavam sequenciando genomas bacterianos mas ninguém sabia
00:00:50.10 qual a função destas sequências
00:00:53.Até que foi notado que elas também tendem a ocorrer
00:00:58.09 com uma série de genes que muitas vezes codificam proteínas
00:01:03.29 que têm homologia a enzimas que fazem coisas interessantes
00:01:09.03 como a reparação do DNA.
00:01:10.12 Então era uma hipótese que este sistema
00:01:14.04 que veio a ser chamado CRISPR
00:01:16.08 que é um acrônimo para este tipo de locus repetitivo
00:01:19.14 que estes sistemas CRISPR poderiam na verdade ser
00:01:22.29an acquired immune system in bacteria
00:01:26.00 that might allow sequences to be integrated
00:01:29.06from viruses and then some someway used later
00:01:32.07 to protect the cell from an infection
00:01:35.26 com aquele mesmo vírus.
00:01:37.05 Então esta foi uma hipótese interessante
00:01:39.11 e nos envolvemos no estudo disto
00:01:41.18 em meados de 2000, logo após a publicação
00:01:44.15 de três artigos que apontaram
00:01:47.13 a incorporação de sequências virais
00:01:50.00 nestes loci genómicos.
00:01:52.07 E assim o que emergiu nos próximos anos
00:01:55.17 foi que de facto estes sistemas CRISPR
00:01:58.08realmente são sistemas imunológicos adquiridos em bactérias
00:02:01.18so até este ponto ninguém sabia que as bactérias
00:02:04.24c poderiam realmente ter uma maneira de se adaptar
00:02:08.08 a vírus que entram na célula
00:02:10.29mas esta é uma maneira que eles fazem isso
00:02:12.14 e envolve a detecção de DNA estranho
00:02:15.17 que é injetado como mostrado neste exemplo
00:02:18.04de um vírus que entra na célula
00:02:20.07 o sistema CRISPR permite a integração
00:02:26.06 de pedaços curtos dessas moléculas de DNA viral
00:02:29.15 no locus CRISPR
00:02:31.07 e então no segundo passo
00:02:33.27 que é mostrado aqui como biogênese do RNA CRISPR
00:02:38.A 20ª sequência CRISPR é na verdade transcrita
00:02:42.20 na célula em pedaços de RNA
00:02:45.15 que são subsequentemente usados juntos
00:02:48.23 com proteínas codificadas pelos genes CAS
00:02:52.09estes genes associados ao CRISPR
00:02:54.01 para formar complexos interferentes ou interferentes
00:02:58.12 que podem usar a informação na forma
00:03:01.17 destas moléculas de RNA para o par base
00:03:04.08 com seqüências correspondentes no DNA viral.
00:03:07.18 Então uma maneira muito elegante que as bactérias
00:03:10.12 têm inventado para pegar seus invasores
00:03:13.06 e virar a informação da seqüência contra eles
00:03:17.00 Então no meu próprio laboratório
00:03:20.20.21 estamos muito interessados há muito tempo
00:03:23.09 entendendo como moléculas de RNA
00:03:26.03 são usadas para ajudar as células a descobrir
00:03:32.00 como regular a expressão das proteínas
00:03:34.03do genoma.
00:03:35.05 E assim isto também pareceu muito interessante
00:03:37.27exemplo disto e
00:03:39.18 começamos a estudar os mecanismos moleculares básicos
00:03:42.24 pelo qual este caminho opera.
00:03:45.01 E em 2011 fui a uma conferência científica
00:03:49.23 e conheci um colega meu,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier que é mostrado nesta foto
00:03:56.10 na extrema esquerda e no laboratório de Emmanuelle
00:03:58.14 trabalha em problemas microbiológicos e eles são
00:04:02.11 particularmente interessados em bactérias
00:04:04.00 que são patógenos humanos.
00:04:06.01Estudando um organismo chamado
00:04:08.03Streptococcus pyogenes que é uma bactéria
00:04:11.15 que pode causar infecções muito graves em humanos
00:04:14.25 e o curioso neste bicho foi que ele
00:04:16.25 tem um sistema CRISPR e nesse organismo
00:04:19.06 havia um único gene codificando uma proteína
00:04:21.27 conhecido como Cas9
00:04:23.12 que se mostrou geneticamente necessário
00:04:26.09 para função do sistema CRISPR
00:04:28.16 no Streptococcus pyogenes,
00:04:30.23mas ninguém sabia na época qual era a função
00:04:33.05 daquela proteína.
00:04:34.20 E assim nos reunimos e recrutamos
00:04:37.20 pessoas de nossos respectivos laboratórios de pesquisa
00:04:40.26 para começar a testar a função do Cas9.
00:04:43.17 Então as pessoas chave no projeto
00:04:45.20 são mostradas aqui na fotografia
00:04:48.00 no centro é Martin Jinek
00:04:50.03que é um associado de pós-doutorado no meu próprio laboratório
00:04:52.17 e ao seu lado com a camisa azul
00:04:54.22 é Kryztof Chylinski que era estudante
00:04:57.20 no laboratório da Emmanuelle
00:04:58.26 e assim estes dois caras junto com
00:05:00.21Ines Fonfara que está na extrema direita,
00:05:02.10a postdoc com Emmanuelle
00:05:04.01began doing experiments across the Atlantic
00:05:07.25and sharing their data.
00:05:10.09And what they figured out was that
00:05:13.06Cas9 is actually a fascinating protein
00:05:16.04 que tem a capacidade de interagir com o DNA
00:05:19.28 e gerar uma dupla quebra de fio
00:05:22.02 no DNA em seqüências que combinam
00:05:25.06 a seqüência em um guia RNA
00:05:27.08 e este slide o que você está vendo
00:05:29.06 é que o RNA guia
00:05:30.10 e a seqüência do guia em laranja
00:05:32.11 que pares de bases com um fio
00:05:34.18 do DNA helicoidal duplo
00:05:37.11 e muito importante este RNA
00:05:39.28 interage com uma segunda molécula de RNA
00:05:42.09 chamado de tracr que forma uma estrutura
00:05:46.03 que recruta a proteína Cas9
00:05:47.29 assim aqueles dois RNAs e uma única proteína
00:05:50.13 na natureza são o que é necessário
00:05:52.23 para que esta proteína reconheça
00:05:56.05 o que normalmente seriam DNAs virais
00:05:58.11 na célula e a proteína
00:06:01.13 é capaz de cortar estes,
00:06:02.14literalmente quebrando o DNA helicoidal duplo.
00:06:05.24 E assim quando descobrimos isto
00:06:08.14 pensamos: não seria incrível
00:06:10.26 se pudéssemos realmente gerar um sistema mais simples
00:06:13.29 do que a natureza fez
00:06:15.02 ao ligar estas duas moléculas de RNA
00:06:18.04 para gerar um sistema que seria uma única proteína
00:06:20.16 e um único RNA guia
00:06:22.28 Então a idéia era basicamente levar
00:06:25.17 estes dois RNAs que você vê no outro lado
00:06:29.29 do slide e então basicamente ligá-los juntos
00:06:33.19 para criar o que chamamos
00:06:35.04a RNA.
00:06:36.22Então Martin Jinek no laboratório
00:06:38.25 feito que constrói
00:06:40.21 e fizemos uma experiência muito simples
00:06:44.22 para testar se realmente tínhamos
00:06:46.18a enzima programável de clivagem de DNA
00:06:49.29 e a idéia era gerar pequenos RNAs guia simples
00:06:54.04 que reconhecessem locais diferentes em uma molécula circular de DNA
00:06:59.24 que você vê aqui
00:07:00.21 e os RNAs guia foram projetados
00:07:03.10 para reconhecer as sequências mostradas pelas barras vermelhas
00:07:06.17 na lâmina e a experiência foi então
00:07:10.16 para pegar aquele plasmídeo, aquela molécula circular de DNA
00:07:13.21 e incubá-lo com duas enzimas diferentes de restrição (ou corte),
00:07:18.27ona chamada SalI que corta
00:07:21.23 o tipo de DNA a montante no extremo distante
00:07:25.05 do DNA nesta foto
00:07:26.12 na caixa cinza,
00:07:27.19 e o segundo local sendo direcionado
00:07:31.00 pelo RNA-guia Cas9
00:07:33.13 nestes diferentes locais mostrados em vermelho,
00:07:35.16 E uma experiência muito simples
00:07:37.19 fizemos esta reação de incubação
00:07:39.26 com DNA plasmídeo e este é o resultado
00:07:43.24 e então isto é o que você está olhando
00:07:45.28 é um gel de agarose
00:07:47.29 que nos permite separar
00:07:49.16 as moléculas clivadas de DNA
00:07:51.20e o que você pode ver é que em cada uma destas pistas de reação
00:07:54.22 nós obtemos uma molécula de DNA de tamanho diferente liberada
00:07:58.12 deste plasmídeo duplamente digerido
00:08:00.16 no qual o tamanho do DNA
00:08:03.29corresponde a clivagem nos diferentes locais
00:08:06.11dirigido por estas sequências de RNA guia
00:08:08.26indicado em vermelho
00:08:10.24so que este foi um momento realmente excitante
00:08:12.29atualmente um experimento muito simples que foi
00:08:15.15kingd of an “A ha!” moment
00:08:17.03when we said we really have a programmable DNA cutting enzyme
00:08:22.02and that we can programate it with a short piece of RNA
00:08:24.15to cleave essentially any double stranded DNA sequence
00:08:28.07 de modo que a razão pela qual estávamos tão excitados
00:08:30.23 sobre uma enzima que pode ser programada
00:08:33.19 para gerar quebras duplas de DNA encalhado
00:08:36.01 em qualquer sequência é porque
00:08:39.00 foi um longo conjunto de experimentos
00:08:42.16 na comunidade científica que mostrou
00:08:45.13 que as células têm formas de reparar quebras de DNA duplamente encalhadas
00:08:49.26 que levam a mudanças
00:08:52.02 na informação genômica no DNA
00:08:55.21 assim este é um slide que mostra que
00:08:58.20 após uma dupla quebra de fita é gerada
00:09:01.14 por qualquer tipo de enzima que possa fazer isto
00:09:04.13incluindo o sistema Cas9
00:09:06.05 essas quebras de duplo encalhamento em uma célula
00:09:09.07 são detectadas e reparadas por dois tipos de caminhos
00:09:13.15uma à esquerda que envolve
00:09:17.26uma junção final não homóloga
00:09:20.07 que as extremidades do DNA são ligadas quimicamente
00:09:24.07back geralmente junto com a introdução
00:09:26.18 de uma pequena inserção ou deleção
00:09:28.25 no local da ruptura
00:09:29.27 e do lado direito
00:09:32.01 é outra forma que a reparação ocorre
00:09:34.00 através da homologia da reparação dirigida
00:09:37.22 na qual uma molécula de DNA doador
00:09:39.14 que tem sequências que correspondem àquelas
00:09:43.28flanking the site of the
00:09:45.12double stranded break can be integrated
00:09:48.05 into the genome at the site
00:09:50.10 of the break to introduce new genetic information
00:09:54.06 into the genome
00:09:55.15sso isto deu a muitos cientistas
00:09:59.04 a idéia de que se houvesse uma ferramenta
00:10:01.04 ou uma tecnologia que permitisse
00:10:03.05cientistas ou pesquisadores a introduzir
00:10:06.12quebras duplas em locais alvo
00:10:09.09.00 no DNA de uma célula então juntos
00:10:12.12 com todos os dados de sequenciamento genético
00:10:14.21 que agora estão disponíveis sabemos o
00:10:16.10 toda a sequência genética de uma célula
00:10:18.21 e se você soubesse onde ocorreu uma mutação
00:10:21.20a causa uma doença por exemplo
00:10:23.20 você poderia realmente usar uma tecnologia como esta
00:10:26.25 para introduzir o DNA que consertaria uma mutação
00:10:31.00ou gerar uma mutação
00:10:32.23 você poderia gostar de estudar em um ambiente de pesquisa
00:10:35.04 de modo que o poder desta tecnologia é
00:10:38.28realmente a idéia que agora podemos gerar
00:10:41.20esses tipos de quebras duplas de fio de fita
00:10:43.17a locais que escolhemos como cientistas
00:10:46.17 pela programação Cas9 e depois permitir
00:10:48.13 a célula para fazer reparos que introduzem
00:10:51.04 mudanças genômicas nos locais dessas quebras
00:10:10.54.15mas o desafio era como gerar as quebras
00:10:58.11 em primeiro lugar e assim um número
00:11:00.09 de diferentes estratégias tinha sido produzido
00:11:03.24 para fazer isto em diferentes laboratórios
00:11:05.A maioria deles, e vou mostrar
00:11:08.21dois exemplos específicos aqui
00:11:10.17um chamado núcleos de dedos de zinco
00:11:12.25e os outros domínios efetores TAL
00:11:15.02estes são ambos modos programáveis
00:11:18.08 para gerar quebras duplas no DNA
00:11:20.21 que dependerão do reconhecimento baseado em proteínas
00:11:23.29 de seqüências de DNA, então estas são proteínas
00:11:26.06 que são modulares, e podem ser geradas
00:11:29.12 em diferentes combinações de módulos
00:11:31.22 para reconhecer diferentes sequências de ADN
00:11:34.03 funciona como uma tecnologia
00:11:37.18 mas requer muita engenharia de proteínas
00:11:40.24 para o fazer, e o que é realmente excitante
00:11:43.16sobre esta enzima CRISPR/Cas9
00:11:46.11 é que é uma proteína programada para RNA
00:11:49.25 assim uma única proteína pode ser usada para
00:11:52.09 qualquer site de DNA onde
00:11:54.27 gostaríamos de gerar uma pausa
00:11:56.13 simplesmente mudando a seqüência
00:11:58.16 do RNA guia associado ao Cas9
00:12:00.24so em vez de confiar no reconhecimento baseado em proteínas
00:12:03.06 do DNA em que confiamos
00:12:06.04RNA baseado no reconhecimento do DNA
00:12:08.26 como mostrado na parte inferior, então o que isto significa
00:12:11.03 é apenas um sistema
00:12:12.18 é suficientemente simples de usar
00:12:15.15 que qualquer pessoa com treinamento básico em biologia molecular
00:12:19.05 pode tirar vantagem deste sistema
00:12:20.29 para fazer engenharia de genoma
00:12:22.20 e assim esta é uma ferramenta que realmente
00:12:26.06 Eu penso, preenche um essencial
00:12:29.03 e componente anteriormente ausente
00:12:30.24 do que poderíamos chamar de caixa de ferramentas de TI da biologia
00:12:33.29 que inclui não só a capacidade
00:12:36.00 de sequenciar o DNA e olhar
00:12:38.06 na sua estrutura, sabemos sobre
00:12:39.24 a dupla hélice desde os anos 50
00:12:42.00 e então nas últimas décadas
00:12:44.18 tem sido possível usar enzimas
00:12:46.09 enzimas de restrição semelhantes
00:12:47.26 e a reação em cadeia da polimerase
00:12:49.09 para isolar e amplificar segmentos particulares
00:12:52.19 de DNA e agora com Cas9
00:12:55.10 temos uma tecnologia que permite
00:12:57.15 a engenharia do genoma facile
00:12:59.13 que está disponível para laboratórios de todo o mundo
00:13:03.07 para experimentos que eles podem querer fazer
00:13:05.08 e assim este é um resumo da tecnologia
00:13:10.11 do sistema de 2 componentes
00:13:11.29 conta com a análise da base RNA-DNA
00:13:14.16 para reconhecimento
00:13:15.21 e muito importante por causa da forma
00:13:18.18.24 que este sistema funciona
00:13:19.28 na verdade é bastante direto
00:13:21.18 para fazer algo chamado multiplexação
00:13:24.20 o que significa que podemos programar Cas9
00:13:27.00 com múltiplos RNAs guia diferentes
00:13:28.23 na mesma célula para gerar
00:13:30.19 quebras múltiplas e fazer coisas
00:13:32.06 como cortar grandes segmentos de um cromossomo
00:13:35.01 e simplesmente apagá-los em uma experiência.
00:13:38.25 E assim isto levou a uma verdadeira explosão
00:13:42.03 no campo da biologia e genética
00:13:45.19 com muitos laboratórios ao redor do mundo
00:13:48.08adoptando esta tecnologia
00:13:49.25 para todo tipo de aplicações muito interessantes
00:13:51.15 e criativas
00:13:53.53.13 e este é um slide
00:13:54.24 que na verdade está quase desatualizado agora
00:13:56.11 mas apenas para dar-lhe um sentido
00:13:57.14 do modo que o campo
00:14:00.07 realmente decolou
00:14:01.08 então nós publicamos nosso trabalho original em Cas9
00:14:04.10 em 2012 e até esse ponto
00:14:07.16 havia muito pouca pesquisa
00:14:08.18 em andamento sobre biologia CRISPR em qualquer lugar
00:14:11.12 era um campo muito pequeno
00:14:12.19 e então você pode ver que
00:14:13.27Desde o início em 2013 e estendendo-se
00:14:16.09até agora tem havido esta
00:14:17.21Explosão credível em publicações
00:14:20.16de laboratórios que estão usando
00:14:22.09isto como uma tecnologia de engenharia de genoma
00:14:24.01sso tem sido realmente muito emocionante para mim
00:14:26.25como um cientista básico ver o que começou
00:14:29.22como um projeto de pesquisa fundamental
00:14:31.12 transformado em uma tecnologia que se revela
00:14:34.08 ser muito capacitante para todos os tipos
00:14:35.28 de experiências emocionantes
00:14:37.07 e eu só queria fechar compartilhando
00:14:40.07 com você algumas coisas
00:14:42.17 que estão usando esta tecnologia
00:14:44.17 assim, claro, do lado esquerdo
00:14:47.13 lotes de biologia básica que podem ser feitos agora
00:14:50.02 com a engenharia de organismos modelo
00:14:53.03 e diferentes tipos de linhas celulares
00:14:55.02 que são cultivadas em laboratório
00:14:56.21 para estudar o comportamento das células
00:14:58.13mas também em biotecnologia poder
00:15:01.23 fazer mudanças direcionadas nas plantas
00:15:05.15 e vários tipos de fungos que poderiam ser muito
00:15:07.11 úteis para diferentes tipos de aplicações industriais
00:15:09.29 e depois, claro, em biomedicina
00:15:12.14 com muito interesse no potencial
00:15:14.14 para usar esta tecnologia como uma ferramenta
00:15:17.03 para realmente surgir com novas terapias
00:15:21.06 para doenças humanas acho que é algo
00:15:23.09 isso é muito emocionante e é realmente algo
00:15:26.05 que já está no horizonte
00:15:27.09 e então este slide apenas indica realmente
00:15:30.20 onde eu acho que vamos ver isso indo
00:15:33.15 no futuro com muita coisa interessante
00:15:36.20 e direções criativas
00:15:39.03 que estão vindo em diferentes laboratórios
00:15:41.02 tanto em laboratórios de pesquisa acadêmica
00:15:43.19mas também cada vez mais em laboratórios comerciais
00:15:45.45.29 que vão permitir o uso desta
00:15:49.24 tecnologia para todo tipo de aplicações
00:15:52.18many da qual nem sequer podíamos ter
00:15:54.10imaginado mesmo há dois anos.
00:15:56.05 Tão emocionante e quero apenas reconhecer uma grande equipa
00:16:01.10 das pessoas que estiveram envolvidas no trabalho
00:16:04.22 sobre o projeto comigo e nós
00:16:06.07 tivemos um ótimo apoio financeiro de vários grupos
00:16:11.00 como bem e foi um prazer
00:16:13.00 compartilhar isso com vocês, obrigado.