Aproximações metodológicas
A genética das CAVDs tem sido historicamente ligada à FC desde 1968 quando Kaplan et al. mostraram que quase todos os homens com FC têm azoospermia obstrutiva (OA) devido à CBAVD (Kaplan et al. 1968). O conceito de que formas isoladas de CBAVD e fibrose cística estão ligadas ao mesmo gene foi confirmado logo após a identificação do gene CFTR, em 1989 (Dumur et al. 1990; Anguiano et al. 1992). Entretanto, logo foi observado que 20-40% dos casos de CBAVDs não estavam ligados a mutações do CFTR, sugerindo a possibilidade de heterogeneidade genética (Culard et al. 1994; Chillón et al. 1995). No entanto, durante 25 anos, a genética da CAVD permaneceu restrita ao CFTR. O fato é que o estudo do determinismo genético da infertilidade humana há muito tempo tem sido restrito por restrições metodológicas específicas, sendo que as abordagens tradicionais de base familiar por análise de ligação muitas vezes são inaplicáveis, particularmente no contexto da infertilidade masculina, devido a barreiras psicossociais e culturais. Portanto, até recentemente, os marcadores genéticos comumente usados na prática clínica para explorar uma azoospermia não-obstrutiva (NOA) limitavam-se a anormalidades cromossômicas como a síndrome de Klinefelter e microdeleções cromossômicas Y (Krausz 2011). Contudo, durante a última década, o advento da sequenciação de próxima geração (NGS) permitiu o desenvolvimento de abordagens poderosas baseadas na sequenciação de todo o exoma (WES) ou na sequenciação de todo o genoma (WGS) e na análise de todo o transcriptoma. Aproximadamente 20 genes envolvidos em formas monogênicas de NOA foram recentemente identificados (revisados por Ghieh et al. 2019). Para quase todos esses genes, mutações causais, todas recessivas, foram identificadas em famílias consanguíneas (Yang et al. 2018). Por outro lado, ao nosso conhecimento, casos familiares excepcionais de AIO nunca foram observados em um contexto de consanguinidade, uma limitação que explica em parte porque, apesar das facilidades das novas abordagens genômicas, o número de novos genes identificados na CAVD tem sido muito menor. No entanto, nos últimos anos, duas grandes abordagens complementares contribuíram para a identificação de genes candidatos; as baseadas no estudo de genomas individuais e as baseadas na análise do transcriptoma do canal seminal, principalmente do epidídimo. A primeira levou ao estabelecimento de correlações relevantes entre o iCBAVD e mutações pontuais do gene ADGRG2 identificadas pela análise WES (Patat et al. 2016; Khan et al. 2018), bem como variações do número de cópias dos genes PANK2 e SLC9A3 identificados pela análise de hibridização genômica comparativa (array-CGH) (Lee et al. 2009). As abordagens transcriptómicas utilizando o cDNA microarray ou sequenciamento de RNA conseguiram visar muitos genes candidatos funcionais, particularmente genes cuja expressão está restrita às células do ducto seminal ou cujo perfil de expressão é específico para certas partes do ducto seminal (Browne et al. 2016). Vários destes genes candidatos como ADGRG2 e SLC9A3 foram validados em ratos knockout e sua fisiologia explorada neste modelo animal (Davies et al. 2004; Wang et al. 2017). Recentemente, uma abordagem integrativa multi-económica que combina WGS, análise do metiloma de ADN inteiro e sequenciação do RNA levou à identificação de dois novos genes candidatos, SCNN1B e CA12, num indivíduo com iCBAVD (Shen et al. 2019). Entretanto, apesar desses avanços, ainda não há diagnóstico genético para pelo menos um quarto das CAVDs, a maioria das quais são CUAVDs. Até agora, a hipótese de que estas formas inexplicáveis de CAVD não são o resultado de simples variações genéticas tem sido pouco explorada. É previsível que no futuro, os novos métodos de estudo do epigenoma e o poder das ferramentas bioinformáticas permitirão especificar o papel da regulação epigenómica na ocorrência destas CAVDs isoladas. Entretanto, esta abordagem será ainda mais bem sucedida se for aplicada a coortes de tamanho adequado compostas de pacientes com CAVD perfeitamente fenotípicos de origem étnica homogênea.
Genes implicados em CAVD
Embora o determinismo genético dos NOAs seja caracterizado por significativa heterogeneidade genética com mais de 30 genes identificados (SPGF ), o dos OAs é limitado a muito poucos genes (Ghieh et al. 2019). Portanto, é estabelecido que aproximadamente três quartos dos casos caucasianos de CAVD estão ligados a anomalias em dois genes: CFTR para a maioria dos casos e ADGRG2 para uma minoria (Patat et al. 2016). Outros genes como o SLC9A3 podem estar envolvidos em alguns iCBAVDs mas também fatores epigenéticos ou ambientais com papéis fisiopatológicos muito diferentes.
CFTR (MIM#602421) foi identificado por clonagem posicional em 1989 por Riordan et al. (1989) terminando vários anos de pesquisa competitiva para descobrir o único gene responsável pela DCF. Aproximadamente metade dos pacientes com FC de descendência do norte da Europa são homozigotos para uma deleção de três pares de bases (NM_000493.3:c.1521_1523del), resultando na perda da fenilalanina 508 (NP_000483.3:p.Phe508del, nome herdado: F508del). Em média, 1 em cada 40 indivíduos na população caucasiana é heterozigoto para a mutação do p.Phe508del, tornando-a uma das mutações patogênicas humanas mais frequentes (Kerem et al. 1989). CFTR, que cobre 250 kb no braço longo do cromossomo 7 em 7q31.2, contém 27 exões codificadores e produz várias transcrições, das quais apenas uma, um mRNA de 6.1-kb, codifica uma proteína funcional de 1.480 aminoácidos chamada CF transmembrane conductance regulator (CFTR). O CFTR é uma proteína transmembrana glicosilada expressa na membrana apical de muitas células epiteliais onde funciona principalmente como um canal de cloreto cAMP-regulado. Muitos estudos têm demonstrado que o CFTR está envolvido na regulação de vários transportadores de íons incluindo canal de sódio (ENacs), trocadores de cloro/bicarbonato, trocadores de prótons (Na+/H+), e canais de água (aquaporinas). Portanto, os processos fisiológicos dependentes do CFTR têm um papel crucial na manutenção da homeostase de íons, pH e água em fluidos epiteliais secretos (Choi et al. 2001). Em 3 décadas, mais de 2000 mutações foram relatadas no CFTR (https://www.genet.sickkids.on.ca/), mas menos de um quarto são classificadas como patógenos (https://www.cftr2.org/) com base em correlações com FC ou outras condições que frequentemente têm um prognóstico menos severo, limitado a um único órgão como os brônquios (bronquiectasias disseminadas, MIM#211400), o pâncreas (pancreatite crônica MIM#167800) ou o vaso deferente (ausência bilateral congênita de vaso deferente, MIM#277180). Estas condições que não preenchem todos os critérios para fibrose cística mas estão relacionadas com disfunção do CFTR foram agrupadas sob o termo genérico CFTR-RD (Bombieri et al. 2011). Todas as regiões do CFTR podem ser afetadas por mutações causadoras de doença, incluindo regiões promotoras e regiões intrônicas profundas (Feng et al. 2019; Bergougnoux et al. 2019). Dependendo de seus efeitos na biogênese e funções do CFTR, os alelos patogênicos são classificados em duas categorias principais: variantes causadoras de FC (também chamadas “graves”) que, no estado homozigoto, estão sempre associadas a variantes causadoras de FC e não-CF que nunca foram observadas em pacientes com FC e que, portanto, são erroneamente chamadas de alelos “leves”. Uma minoria de alelos causadores de FC tem sido observada em formas clínicas variáveis de fibrose cística mais ou menos grave, nas quais a função pancreática é frequentemente preservada. A patogenicidade desses alelos chamados VCC (para variantes de conseqüência clínica variável) pode depender de fatores genéticos raramente conhecidos, como a associação cis com alelos complexos ou fatores não genéticos desconhecidos. Ao contrário das variantes causadoras de FC, as variantes não causadoras de FC causam uma disfunção incompleta do CFTR. Dependendo do órgão, se a atividade residual do CFTR for muito baixa para manter a homeostase, um CFTR-RD pode aparecer. Portanto, os sujeitos com CFTR-RD geralmente carregam uma variante não causadora de CFTR mais freqüentemente combinada em trans com uma variante causadora de CF ou, mais raramente, com outra variante não causadora de CFTR. Estes alelos são por vezes referidos como alelos causadores de CFTR-RD.
ADGRG2 (MIM#300372) localizado em Xp22.13 é composto por 29 exons que produzem aproximadamente dez transcrições, a mais longa das quais tem um quadro de leitura aberta de 3,1 kb (cobre exons 3-29) que codifica para o receptor de aderência G acoplado à proteína G2 (ADGRG2). Seu cDNA foi inicialmente clonado em 1997 por Osterhoff et al. (1997) após a triagem diferencial de uma biblioteca de células epidídimas humanas de cDNA, na qual este clone, denominado HE6 (para a proteína epidídimis específica 6 humana) foi amplamente representado. Com uma sequência deduzida de 1017 aminoácidos e seus sete domínios transmembrana altamente preservados, a proteína HE6 pertence à superfamília receptora de proteína G (GPCR), na qual foi originalmente referida como GPR64. A estrutura e propriedade autocatalítica da parte extracelular da HE6/GPCR64 levou à sua classificação final na sub-família G da aderência GPCR (aGPCR) (Hamann et al. 2015). ADGRG2 é uma proteína altamente glicosilada quase exclusivamente e altamente expressa na parte proximal dos ductos seminais masculinos (https://proteinatlas.org), precisamente no epitélio dos ductos eferentes e na parte inicial do ducto epididimal. A imunomarcação ADGRG2 é particularmente forte nos estereocílios das principais células epidídimas e nos microfiliais das células não celíacas dos ductos eferentes, onde 90% do fluido secretado pelo testículo é reabsorvido (Kirchhoff et al. 2008; Patat et al. 2016). O envolvimento do ADGRG2 neste processo foi inicialmente sugerido pelo nocaute HE6/GPR64 (ruptura dirigida) em camundongos, o que, em homens hemígeos, resulta num acúmulo de fluido no testículo e estase espermática nos ductos eferentes levando a um fenótipo de infertilidade obstrutiva (Davies et al. 2004). O ADGRG2 é um receptor órfão com ligandos naturais desconhecidos e vias de sinalização parcialmente elucidadas. Como a maioria dos aGPCRs, o ADGRG2 maduro é um heterodímero resultante da clivagem em um domínio altamente preservado contendo o sítio de proteólise GPCR (GPS) em um fragmento extracelular N-terminal (FNT) não covalentemente ligado a um grande fragmento C-terminal (FTC) ancorado na membrana celular (Obermann et al. 2003). Como essas duas subunidades cooperam sob a ação de agonistas endógenos para mediar sinais e têm funções específicas separadas são questões que permanecem sem resposta. No entanto, foi demonstrado que a extremidade extracelular da CTF resultante da clivagem carrega uma sequência Stachel com propriedades agonísticas (Demberg et al. 2015). Além disso, dados experimentais recentes obtidos em modelos in vitro e in vivo mostram que via Gs e Gq a sinalização mediada por proteína, ADGRG2, é capaz de modular a atividade c-AMP e PKC, respectivamente (Demberg et al. 2017; Balenga et al. 2016; Zhang et al. 2018).
Causal mutations in CAVD, type, and epidemiology
Mutações CFTR
Menos de um ano após a identificação do gene CFTR (Riordan et al. 1989), Dumur et al. observaram uma frequência anormalmente alta de mutação do p.Phe508del em uma pequena série de homens inférteis com iCBAVD (Dumur et al. 1990). Esta descoberta, que suportou a hipótese de que a iCBAVD poderia ser uma forma monossintomática de fibrose cística, teve uma grande consequência médica. Posteriormente, todos os homens com iCBAVD submetidos a tecnologias de reprodução medicamente assistida (ART) por recuperação cirúrgica de espermatozóides e injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) deveriam ser considerados como tendo maior risco de ter uma criança com fibrose cística (Anguiano et al. 1992). Posteriormente, Chillon et al. confirmaram que, ao contrário dos pacientes com FC que carregam apenas mutações causadoras de FC responsáveis por uma perda completa da função do canal de cloreto CFTR, os pacientes com iCBAVD carregam pelo menos uma cópia do CFTR com a chamada mutação “leve”, pois esta se correlaciona com uma atividade reduzida ou parcial do CFTR de 3-8% (Chillón et al. 1995). Esta situação é bem ilustrada por uma variante de polimidina (Tn) polimorfismo no intron 9 (NM_000493.3:c.1210-12T), o chamado alelo IVS8-5T (alelo 5T) cuja frequência é quatro a cinco vezes maior em indivíduos com iCBAVD (revisado por De Sousa et al. 2018). Este alelo 5T tem um efeito deletério na emenda que promove o salto do exon 10 levando a uma redução significativa no mRNA do CFTR normal (Chu et al. 1993). Até um terço dos sujeitos iCBAVD de descendência europeia são heterozigotos compostos portadores de uma mutação causadora de FC, sendo o mais frequente o F508del, e o alelo 5 T em trans (Chillón et al. 1995). Entretanto, como esse genótipo havia sido observado em pais férteis que tiveram um filho com FC, Cuppens et al. mostraram que a penetração desse alelo 5 T em relação ao exon 10 saltando dependia principalmente do tamanho de uma sequência polimórfica de poliTG (NM_000493.3:c.1210-34TG) a montante da sequência de poliT (Cuppens et al. 1998). Assim, enquanto a variante polivalente TG(11)5T (NM_000493.3:c.1210-34TGT) é encontrada esmagadoramente em indivíduos saudáveis, é a combinação TG(12)5T que é mais frequentemente encontrada em indivíduos iCBAVD, enquanto o alelo muito mais raro TG(13)5T é sempre identificado em indivíduos iCBAVD (Groman et al. 2004). Nos últimos 20 anos, inúmeros estudos tornaram possível a caracterização do espectro da mutação do CFTR em indivíduos com CBAVD, especificando sua freqüência de acordo com a etnia e origem geográfica (revisado por Yu et al. 2012). Enquanto os mesmos tipos de mutações graves, incluindo grandes rearranjos do CFTR (Taulan et al. 2007), são encontrados tanto em sujeitos CF-CBAVD quanto em sujeitos iCBAVD, o espectro mutacional do CFTR no iCBAVD é radicalmente diferente na medida em que há muitas mutações não causadoras de CFTR, a maioria das quais pode ser associada a outros fenótipos CFTR-RD como pancreatopatias, bronquiectasias disseminadas e distúrbios sinonasais (Bombieri et al. 2011). Essas mutações “leves” incluem principalmente variantes intrônicas que afetam a emenda, sendo a mais freqüente o alelo 5T, e numerosas mutações de missense que afetam o funcionamento do canal clorídrico, sendo a mais freqüente nos caucasianos a mutação p.Arg117His (R117H) (Casals et al. 2000; Claustres et al. 2000). A maioria dessas mutações não causadoras de FC não são detectadas por painéis de rotina projetados para a população clássica de FC, que visam principalmente as mutações causadoras de FC mais frequentes (numerosos kits comerciais disponíveis). É por isso que, para diagnóstico molecular de CBAVDs e outras CFTR-RDs, é recomendado escolher um teste CFTR que inclua as duas principais variantes “leves”, R117H, e o alelo 5T como teste de primeira linha (veja abaixo o capítulo “Implicações para a prática clínica …”). Se isto for inconclusivo, deve ser feita uma caracterização abrangente do CFTR, incluindo pelo menos o sequenciamento de todos os exons e regiões intrônicas de flanco, bem como uma busca por grandes rearranjos. Métodos de diagnóstico molecular baseados no sequenciamento de nova geração (NGS) são cada vez mais utilizados para a detecção não só de mutações pontuais, mas também de grandes deleções ou duplicações. Esses novos métodos de escaneamento genético que podem ser aplicados a um painel permitem evitar o laborioso sequenciamento Sanger e técnicas de PCR semi-quantitativas (MLPA, QMPSF, qPCR, etc.) realizadas exon por exon.
As frequências de mutações CFTR em pacientes com CAVD diferem de estudo para estudo, provavelmente devido a um viés de recrutamento, tamanho da coorte e à heterogeneidade dos métodos de genotipagem, sendo que muitos sujeitos tiveram uma análise parcial do CFTR. Entretanto, é claro que a frequência de alguns alelos é muito diferente em pacientes caucasianos com CAVD e naqueles de países não caucasianos nos quais a fibrose cística é muito mais infrequente. Este é particularmente o caso da mutação F508del, que é excepcionalmente detectada em doentes chineses com iCBAVD, enquanto que até um terço dos doentes com iCBAVD no norte da Europa são portadores. Por outro lado, pacientes com iCBAVD de origem asiática são mais frequentemente portadores do alelo 5T do que caucasianos (Tabela 1), enquanto a frequência deste alelo na população geral varia pouco em todo o mundo (5%). Em geral, a meta-análise dos dados publicados por Yu et al (2012) indica que aproximadamente 80% dos pacientes caucasianos com iCBAVD são portadores de pelo menos uma mutação no CFTR. O estudo mais exaustivo possível deixa 6% dos sujeitos sem qualquer mutação detectada (Ratbi et al. 2007). Considerando que alguns desses pacientes podem ser heterozigotos simples (3% na população caucasiana) e outros portadores de variantes de significância desconhecida que são possivelmente neutras (não causadoras de FC ou CFTR-RD), pode-se supor que o CFTR estaria implicado em 75-80% dos casos de iCBAVD. Portanto, para aproximadamente um quarto dos pacientes com iCBAVD, a responsabilidade do CFTR não pode ser definitivamente comprovada, enquanto para os pacientes com FC, os dois alelos mutantes podem ser caracterizados em 99% dos casos (Tabela 1). Para os CUAVDs, 30-50% dos sujeitos sofrem pelo menos uma mutação de CFTR após uma varredura completa do gene, o que significa que mais da metade dos CUAVDs não estão relacionados ao CFTR (Schlegel et al. 1996; Casals et al. 2000; Cai et al. 2019; Mieusset et al. 2020). A presença de uma anormalidade renal é muito significativamente mais frequente em pacientes com DCRAV nos quais apenas uma ou nenhuma anormalidade CFTR foi detectada (Augarten et al. 1994; Schwarzer & Schwarz 2012). Portanto, pode-se supor que a diferença na taxa de não detecção de mutações CFTR entre CBAVD (20%) e CUAVD (50%) está, pelo menos parcialmente, relacionada à diferença na freqüência de agenesia renal unilateral observada nos dois grupos, 5% vs 25%, respectivamente (Weiske et al. 2000; McCallum et al. 2001; Kolettis e Sandlow 2002; Yang et al. 2015).
Mutações ADGRG2
Em 2016, após selecionar cuidadosamente, a partir de uma grande série retrospectiva de 379 homens iCBAVD de descendência européia, uma coorte de 26 indivíduos sem mutação CFTR ou anormalidade renal associada, Patat et al. identificaram três mutações truncantes hemizigóticas no gene ADGRG2 ligado ao X (MIM#300572.0001_3) em quatro indivíduos (Patat et al. 2016). O estabelecimento do papel causal dessas mutações no fenótipo iCBAVD foi baseado em um conjunto de argumentos: (i) ratos ADGRG2 (KO) masculinos desenvolvem OA sem qualquer outra anormalidade significativa (Davies et al. 2004), (ii) o exame histológico de uma biópsia epididimal de um dos quatro indivíduos mostrou falta de expressão do ADGRG2 no epitélio dos ductos eferentes anormalmente dilatados, (iii) uma das mutações truncadas foi identificada em dois indivíduos inférteis relacionados por um elo materno (um sobrinho e um tio materno). Desde então, três publicações (Yang et al. 2017; Yuan et al. 2019; Khan et al. 2018) relataram a identificação de cinco novas variações raras de ADGRG2 em seis pacientes iCBAVD de origem asiática sem mutação CFTR patogênica: duas mutações sem sentido classificadas como patogênicas, incluindo uma em dois irmãos inférteis de origem paquistanesa (Khan et al. 2018) e três mutações sem sentido, incluindo uma que afetava a região do GPS que foi classificada como patogênica (Yang et al. 2017). Estes seis pacientes não apresentavam anomalias renais. Recentemente, Pagin et al. também relataram seis novas mutações truncantes ADGRG2 em uma coorte de 53 pacientes franceses portadores de 0 ou apenas 1 CFTR de alelo defeituoso. Neste estudo, os autores não conseguiram obter evidências convincentes para sustentar a hipótese de uma herança digênica envolvendo ADGRG2 e CFTR. Eles concluíram que a inativação do ADGRG2 é responsável por aproximadamente 20% da DCVD não relacionada à disfunção do CFTR. Além disso, não encontraram nenhum caso de rim solitário entre os 8 ADGRG2 mutantes da sua coorte (Pagin et al. 2019). Curiosamente, nenhuma mutação ADGRG2 ou CFTR foi identificada por Patat et al. em uma coorte de 28 pacientes iCBAVD com URA (dados pessoais).
Outras mutações
Ao nosso conhecimento, além de CFTR e ADGRG2, as únicas outras mutações que levantaram a questão de uma possível correlação com iCBAVDs são CNVs envolvendo os genes PANK2 e SLC9A3. Até o momento, esses CNVs só foram descritos em pacientes com iCBAVD de Taiwan. Como em outras populações asiáticas, CF e CFTR-RD são raramente observados em Taiwan e, além do alelo IVS8-5T cuja frequência é significativamente aumentada em homens inférteis taiwaneses com iCBAVD, muito poucos alelos CFTR patogênicos foram caracterizados (Chiang et al. 2009). Ao investigar os CNVs usando array-CGH e PCR quantitativa em tempo real em uma pequena coorte de indivíduos iCBAVD de Taiwan, a equipe de HS Chiang identificou em um único indivíduo a perda homozigotos do gene pantotenato quinase 2 (PANK2) (Lee et al. 2009) e em 11 de 29 indivíduos, a perda de uma cópia do gene isoforma portador do soluto 9 (SLC9A3) (Wu et al. 2018; revisado por Chiang et al. 2019). PANK2 foi selecionado como um gene potencial relacionado à reprodução, pois o rato KO tinha azoospermia (Kuo et al. 2005). Entretanto, era um NOA e esta condição não é observada em humanos afetados com neurodegeneração associada ao pantotenato de cianose (MIM#234200). Até o momento, nenhum outro caso de CBAVD relacionado a uma deleção de PANK2 foi relatado. Portanto, a correlação permanece incerta e a observação anedótica. Por outro lado, os dados experimentais obtidos pela mesma equipe sobre o envolvimento do SLC9A3 no fenótipo da CBAVD são substanciais e mais convincentes. De fato, esses autores mostraram que o rato macho adulto SLC9A3-/- desenvolve azoospermia obstrutiva devido a anormalidades estruturais e funcionais dos ductos eferentes com atrofia progressiva a longo prazo dos canais deferentes e vesículas seminais (Wu et al. 2019; Chiang et al. 2019). Notavelmente, os autores observaram uma diminuição drástica do CFTR no epidídimo e no canal deferente nestes ratos SLC9A3-KO sugerindo papéis interdependentes dos dois genes no determinismo iCBAVD (Wang et al. 2017). Entretanto, apesar dessas observações muito esclarecedoras sobre o papel do SLC9A3 na fisiologia do trato reprodutivo de ratos machos, a relação entre a perda de uma cópia desse gene e o iCBAVD em humanos ainda é mal compreendida. Considerando que as mutações recessivas da SLC9A3 causam uma forma grave de diarréia congênita por secreção de sódio (diarréia secretora de sódio congênita, MIM#616868) e que as mutações por perda de função, incluindo uma deleção completa da SLC9A3, demonstraram ser transmitidas por pais heterozigotos (Janecke et al. 2015), a CBAVD de pacientes taiwaneses não pode ser explicada apenas pela haploinsuficiência da SLC9A3. Além disso, Wu et al. relataram em seu estudo que entre os 29 pacientes taiwaneses com iCBAVD, 6 (20,7%) foram encontrados homozigotos ou heterozigotos compostos para os alelos CFTR TG(12)5T ou TG(13)5T, um status genotípico que poderia ser suficiente por si só para causar iCBAVD. Destes seis indivíduos, dois tinham apenas uma cópia do SLC9A3. Desta mesma coorte, 12 outros pacientes com iCBAVD eram heterozigotos para o alelo TG(12)5T ou TG(13)5T, metade dos quais também tinha uma deleção do SLC9A3 (Wu et al. 2019). A possibilidade de digenismo envolvendo variações do CFTR como o alelo 5T ainda é altamente especulativa. Deve-se observar que nenhum desses 29 pacientes taiwaneses com DCVM teve uma ausência renal unilateral.