Frontiers in Oncology

Introduction

É sabido que a infecção persistente com papilomavírus humano de alto risco (hr-HPV) é uma causa necessária para o cancro do colo do útero e lesões pré-cancerosas (1, 2). Com uma etiologia revelada, o cancro do colo do útero é altamente prevenível (3, 4). Os países desenvolvidos começaram a utilizar o teste de HPV-HPV no rastreio primário do cancro do colo do útero, quer isoladamente quer em co-teste com a citologia (5-8). As evidências mostram que os programas de rastreio baseados no HPV oferecem maior protecção contra o pré-câncer do colo do útero e cancro do que outros métodos tradicionais de rastreio, como a citologia (9-11). Contudo, uma vez que a maioria das infecções por HPV pode ser eliminada espontaneamente, o teste de HPV identifica numerosas infecções que não progredirão para o pré-câncer cervical ou cancro, especialmente em mulheres jovens (12). Por conseguinte, não é recomendado o teste de DNA para o HPV para rastrear mulheres com menos de 30 anos de idade. Além disso, as pacientes HPV-positivas encaminhadas para procedimentos subsequentes podem sofrer de intervenções invasivas desnecessárias.

Na China, houve 98.900 novos casos e 30.500 mortes por cancro do colo do útero em 2015 (13). Para frear a tendência crescente desta malignidade, o governo chinês tem fornecido, desde 2009, um programa nacional de rastreamento gratuito do câncer do colo do útero para mulheres que vivem em áreas rurais, utilizando testes VIA/VILI, Papanicolaou (Papanicolaou) ou HPV (em locais piloto), baseado em níveis de desenvolvimento econômico e tecnológico (14). No entanto, devido à natureza desses métodos de rastreio, a precisão diagnóstica precisa de ser melhorada. Além disso, considerando a grande população da China, uma nova ferramenta de triagem com equilíbrio entre sensibilidade e especificidade deve ser avaliada.

Marcadores moleculares de câncer do colo uterino específicos da doença fornecem uma combinação de alta sensibilidade e alta especificidade para detectar o pré-câncer cervical. A maioria destes marcadores foi identificada com base no mecanismo da carcinogênese relacionada ao HPV. O teste do RNA do HPV baseia-se na detecção do HR-HPV E6 e E7 mRNA. O potencial oncogénico da infecção pelo HPV depende da produção de oncoproteínas virais E6/E7. Assim, a detecção das transcrições do E6/E7 mRNA fornece a possibilidade de um teste específico para detectar lesões pré-cancerosas.

Neste estudo, avaliamos o desempenho clínico do teste HPV E6/E7 mRNA para detectar neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau (NIC) e câncer entre mulheres chinesas.

Materiais e Métodos

Participantes e Procedimentos

Este estudo hospitalar foi realizado entre abril e dezembro de 2017 na província de Henan, China. Foram convidadas mulheres que visitaram o departamento de ginecologia do Segundo Hospital Filiado da Universidade de Zhengzhou (SAHZU) para a colposcopia. Os critérios de inclusão foram os seguintes: (1) mulheres entre 25 e 64 anos de idade; (2) nenhum histórico de câncer cervical ou histerectomia; (3) nenhum sintoma clínico de gravidez ou 8 semanas após a interrupção da gravidez; e (4) compreender os procedimentos do estudo e participar voluntariamente. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) do Henan Cancer Hospital (HCH). O consentimento livre e esclarecido por escrito foi obtido de cada participante.

As células esfoliadas cervicais foram obtidas de mulheres durante o exame ginecológico. A amostra foi preservada em 20 ml de meio de transporte PreservCyt® (Hologic Inc., Marlborough, MA, Estados Unidos) e armazenada a 4°C. Em seguida, o exame de colposcopia foi realizado por um ginecologista. Mulheres com achado de colposcopia anormal foram submetidas a biópsia com alvo de lesão. Se o exame de colposcopia era insatisfatório (a junção escamocolunar não era completamente visível), foi realizada uma curetagem endocervical (CEC). Os espécimes de células esfoliadas cervicais foram transportados para o Instituto e Hospital do Câncer, Academia Chinesa de Ciências Médicas (CICAMS). Os espécimes foram divididos em duas porções: uma mistura de 1,5 ml de células em um tubo de EP para o teste de DNA HR-HPV e o teste HPV E6/E7 mRNA. O preservcyt residual com células esfoliadas foi usado para o teste citológico ThinPrep (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, Estados Unidos). O sistema de relato Bethesda foi usado para citologia por um citologista sênior (15).

RH-HPV DNA Assay

As 400 μl amostras de mistura de células de 1,5 ml de tubos EP foram usadas para a detecção de DNA de 14 tipos de Hr-HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, e 68) pelo ensaio Cobas 4800 HPV (Roche, Basel, SUI). Ele relatou o resultado combinado de 14 hrHPV, e o resultado separado para HPV 16 e 18, simultaneamente (16). Cobas 4800 foi um teste baseado em PCR para ADN HPV com amplificação de hibridação do ácido nucleico de acordo com as instruções do fabricante. Foram estabelecidos controlos de qualidade negativos e positivos em cada teste. Se o valor ct foi superior a 40, o resultado foi considerado negativo. Caso contrário, o resultado era positivo. Os resultados positivos incluíam três tipos: HPV 16, HPV 18, e HPV outros (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, e 68).

PV E6/E7 teste de mRNA

Uma amostra de 1,5 ml de tubos EP foram usados para a detecção do mRNA viral E6/E7 dos tipos de 14 hr-HPV no teste APTIMA HPV agregado (Hologic Inc., Marlborough, MA, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante (17). Foi um teste em três etapas, incluindo extração de mRNA, amplificação e detecção de produto amplificado. Se o número de cópias foi maior ou igual a 1,0, o resultado foi considerado como positivo. Caso contrário, o resultado foi negativo.

Diagnóstico histopatológico

Tecidos de Biópsia e CEC foram enviados à SAHZU para diagnósticos histopatológicos de acordo com o sistema de relato de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC). Em seguida, os histopatologistas da HCH revisaram todas as lâminas. Qualquer diagnóstico anatomopatológico inconsistente foi enviado ao CICAMS para julgamento. O diagnóstico final para cada mulher foi baseado na pior leitura da revisão do painel. Todo o processo de detecção e diagnóstico foi cego.

Análise Estatística

O diagnóstico histopatológico final foi utilizado como padrão ouro. Mulheres com diagnóstico de TCT de lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LSIL) ou pior (LSIL +) foram consideradas como citologia de base líquida (LBC) positivas. Os resultados do DNA do HPV foram estratificados, de acordo com os tipos de HPV: HPV16/18 (isto é, HPV16 e/ou HPV18 positivos), HPV-outros (isto é, qualquer um dos tipos de 12 hr-HPV positivos excluindo HPV16 e HPV18), e HPV-total (isto é, qualquer um dos tipos de 14 hr-HPV positivos). Foram calculadas as estimativas absolutas e intervalos confidenciais de 95% (95%CI) de taxas positivas, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (PPV) e valor preditivo negativo (NPV). As diferenças nas expressões do mRNA do HPV em diferentes grupos de HPV foram calculadas usando o teste do qui-quadrado ou o teste exato de Fisher. O teste McNemar foi usado para identificar as diferenças de sensibilidade e especificidade. O nível α foi definido em 0,05, e p < 0,05 (dois tamanhos) foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

No total, 537 mulheres foram incluídas nesta análise. A média de idade foi de 43,88 ± 10,97 anos. Os diagnósticos de LBC foram: 183 (34,7%) normais, 135 (25,1%) células escamosas atípicas de significância indeterminada (ASC-US), 22 (4,1%) células escamosas atípicas não podem excluir HSIL (ASC-H), 7 (1.3%) célula glandular atípica (AGC), 82 (15,3%) LSIL, 75 (14,0%) lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL), 31 (5,8%) carcinomas espinocelulares (CEC), e 2 (0,4%) adenocarcinoma in situ (AIS). O diagnóstico histopatológico foi 298 (55,5%) normal, 30 (5,6%) neoplasia intra-epitelial cervical grau 1 (NIC1), 48 (8,9%) NIC2, 111 (20,7%) NIC3, 43 (8,0%) SCC, e 7 (1,3%) AIS.

Tabela 1 mostrou a correlação entre mRNA e detecção de DNA por tipos de HPV. A concordância total dos dois testes foi de 90,7% (IC95%: 87,9, 92,9) com um valor kappa de 0,81. As taxas positivas de mRNA foram de 91,7%, 84,6% e 86,4% no HPV16/18, HPV-outros, e HPV-total de mulheres positivas, respectivamente. Todas as taxas de mRNA positivas foram maiores em mulheres HPV-positivas do que em mulheres HPV-negativas no mesmo grupo tipo HPV (todas p < 0,001).

As taxas positivas de DNA, mRNA e LBC do HPV aumentaram com a gravidade do diagnóstico histopatológico, variando de 25,5, 19,1 e 11,4% no normal a 100,0% no CCS, respectivamente. As taxas positivas dos três testes no AIS foram de 85,7, 85,7 e 100,0%, respectivamente. Estes três testes tiveram taxas positivas semelhantes no CIN3, SCC, e AIS. Mas as taxas positivas de mRNA foram relativamente mais baixas em mulheres sob o diagnóstico de NIC2. As taxas de HPV16 positivas foram as mais altas no CIN3, SCC e AIS, quando comparadas com outros grupos de DNA do HPV. As taxas positivas de HPV18 foram inferiores a 7% em todas as lesões de células escamosas, mas um pouco maiores (28,6%) no AIS (Tabela 2).

Tabela 3 mostraram o desempenho clínico dos três testes na detecção de lesões CIN2+ e CIN3+. As sensibilidades para o mRNA detectar o NIC2+ e NIC3+ foram de 93,8% (IC95%: 89,7-96,4) e 95,7% (IC95%: 91,3-97,9), respectivamente, que não foram diferentes daquelas detectadas pelo DNA (95,7% para NIC2+, 96,3% para NIC3+), mas superiores às detectadas pelo LBC (80,4% para NIC2+ e 88,8% para NIC3+). As especificidades do mRNA para detectar CIN2+ (79,0% ) e CIN3+ (70,5% ) foram significativamente superiores às detectadas pelo DNA (71,0% para CIN2+, 62,8% para CIN3+) (p < 0,05), mas inferiores às detectadas pelo LBC (84,5% para CIN2+, 79,8% para CIN3+). Os PPVs para mRNA para detecção de CIN2+ e CIN3+ foram 74,0% (IC95%: 68,4-78,9) e 58,1% (IC95%: 52,1-63,9), e os NPVs foram 95,2% (IC95%: 92,0-97,2) e 97,4% (IC95%: 94,8-98,8), respectivamente.

Quadro 4, 5 mostrou as taxas positivas e o desempenho clínico dos três testes em diferentes faixas etárias. Em resumo, todos os testes mostraram melhor desempenho para mulheres com mais de 30 anos do que para mulheres mais jovens. O teste de DNA do HPV teve a maior sensibilidade, e o LBC teve a maior especificidade para detecção de CIN2+ e CIN3+ em mulheres com menos de 30 anos.

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Discussão

Os resultados apresentados mostraram que o teste de mRNA e a tetina de DNA chegaram a uma alta concordância de 90,7%. As taxas de DNA do HPV, mRNA e LBC positivos aumentaram com a gravidade do diagnóstico histopatológico, de 25,5, 19,1 e 11,4% em normal para 100,0% em CEC, respectivamente. As sensibilidades para o mRNA detectar o CIN2 e CIN3+ foram de 93,8% e 95,7%, semelhantes às detectadas pelo DNA (95,7% para o CIN2+ e 96,3% para o CIN3+). Mas as especificidades do mRNA (79,0% para o CIN2+ e 70,5% para o CIN3+) foram significativamente maiores que as detectadas pelo DNA (71,0% para o CIN2+ e 62,8% para o CIN3+).

Neste estudo, o teste HPV E6/E7 mRNA e o teste HPV DNA mostraram alta concordância. Dessas mulheres HPV 16/18 positivas ao DNA, 91,7% também foram positivas ao mRNA, que é semelhante a outros estudos, que relataram uma concordância global de mais de 90% entre o teste APTIMA HPV e os testes de DNA HPV (17, 18), e taxas consistentemente mais altas de positivos para o teste de DNA HPV em diferentes populações (19, 20). Notamos taxas positivas mais altas em mulheres mais velhas do que em mulheres mais jovens, o que foi ligeiramente diferente de outros estudos (21-23). Esta variação pode ser atribuída ao desenho do estudo (ou seja, estudo baseado em hospital), o que limita a extrapolação dos resultados para a população em geral. Curiosamente, a taxa discordante foi maior em mulheres com 30 anos ou menos (25,6% vs. 8,6%). Estudos demonstraram uma maior taxa de depuração espontânea da infecção pelo HPV em mulheres mais jovens, o que indicou uma menor possibilidade de integração do HPV (24).

Como sabemos, os testes baseados no DNA do HPV detectam a presença ou ausência do DNA do HPV. No entanto, a maioria das infecções por HPV são transitórias, eliminadas espontaneamente dentro de 1 ano, o que não progride para o pré-câncer cervical ou cancro (25). A expressão do E6/E7 mRNA só ocorre em células infectadas activamente e aumenta durante o desenvolvimento e progressão do NIC (26). Portanto, o teste do mRNA do HPV deve ser mais específico na detecção de lesões cervicais de alto grau. Os nossos dados confirmaram esta hipótese. Descobrimos que o teste de mRNA foi tão sensível quanto o teste de DNA, mas mais específico na detecção de pré-câncer cervical e câncer. Outros pesquisadores tiraram conclusões semelhantes tanto no rastreamento primário (20) quanto na triagem de mulheres com citologia anormal menor (27). Em nosso estudo, 50 mulheres tiveram resultados discordantes entre o teste de DNA do HPV e o teste de mRNA. Entre elas, 34 DNA + /mRNA- versus 8 mRNA + /DNA- foram diagnosticadas como normais ou CIN1; 6 versus 2 foram diagnosticadas como CIN2 ou CIN3; nenhuma diferença no teste foi observada em cânceres. Portanto, se substituirmos o teste de DNA do HPV pelo teste do mRNA, 34 mulheres não seriam encaminhadas para colposcopia desnecessária, mas 4 CIN2 e 2 CIN3 não seriam diagnosticados. Apesar de faltarem 6 casos, não houve perda de sensibilidade, mas a especificidade aumentou. A literatura mostrou que 40-60% dos casos de NIC2 regrediriam em 2 anos (28, 29), e nem todos os casos de NIC3 eram lesões pré-cancerosas verdadeiras (30). Cook et al. também encontraram uma baixa taxa de NIC2+ entre mRNA-/DNA + mulheres (17). Portanto, o risco de câncer invasivo para as 6 mulheres foi baixo em um curto intervalo de tempo.

Avaliamos também o desempenho do teste em mulheres mais velhas e mais jovens. A análise específica por idade revelou que os três testes funcionaram melhor em mulheres com mais de 30 anos de idade. Com base no fato de que mulheres mais jovens com lesões NIC tinham maior possibilidade de regressão, sugerimos um manejo conservador de mulheres mais jovens. Estudos constataram que a infecção pelo HPV era comum em mulheres jovens, no entanto, uma grande parte delas eram infecções transitórias e podem ser eliminadas espontaneamente (31, 32). A curta duração da maioria das infecções por HPV nestas mulheres sugere que a displasia cervical associada deve ser tratada de forma conservadora (12). Portanto, o teste de DNA do HPV pode não ser um método adequado de triagem para mulheres com menos de 30 anos de idade, devido à alta taxa de falso-positivo. O desempenho do rastreio da citologia e do E6/E7 mRNA de forma abrangente em mulheres jovens deve ser avaliado. Em nosso estudo, os dados mostraram que a citologia teve a maior especificidade em mulheres menores de 30 anos, mas a sensibilidade é menor do que o teste de DNA do HPV. Contudo, para o E6/E7 mRNA, teve um desempenho moderado em mulheres com menos de 30 anos, que teve uma sensibilidade mais elevada do que a citologia acompanhada de uma maior especificidade do que o DNA do HPV, sugerindo que o teste E6/E7 mRNA pode ser uma opção promissora para o rastreio de mulheres com menos de 30,

Embora a Administração de Alimentos e Medicamentos da China tenha aprovado três vacinas profiláticas contra o HPV (ou seja, Cervarix, Gardasil e Cecolin), a prevenção do cancro do colo do útero ainda depende do rastreio. Em 2009, o governo chinês lançou um rastreio gratuito do cancro do colo do útero em todo o país para mulheres rurais. Em 2015, o teste de DNA do HPV foi usado pela primeira vez como uma ferramenta primária de rastreio em sítios piloto. No entanto, devido à sua grande população, o rastreio baseado no ADN HPV resultaria em enormes falsos positivos inevitáveis, levando a um desperdício de recursos de saúde e a ansiedade desnecessária. É promissor que o mRNA poderia ser usado no programa nacional de rastreio do cancro do colo do útero para reduzir os falsos positivos sem perder qualquer sensibilidade.

As limitações transversais devem ser abordadas neste estudo. Em primeiro lugar, este é um estudo transversal, e não pudemos avaliar o risco de progressão da lesão associada ao HPV E6/E7 mRNA. Entretanto, estratificamos nossos dados por grau histológico, o que nos fornece informações sobre a correlação. Em segundo lugar, é importante notar que os resultados não podem ser totalmente generalizados à população em geral, pois os participantes do estudo foram recrutados do ambulatório no hospital.

Em conclusão, o teste APTIMA mRNA teve boa concordância com o teste de DNA do HPV Cobas 4800 com sensibilidade semelhante e maior especificidade para detectar lesões cervicais de alto grau. É promissor que o mRNA poderia ser usado no programa nacional da China de rastreio do cancro do colo do útero para reduzir os falsos positivos sem perder qualquer sensibilidade. Outros estudos são necessários para avaliar o desempenho clínico do teste de mRNA em mulheres mais jovens na China.

Data Availability Statement

Todos os conjuntos de dados gerados para este estudo estão incluídos no artigo/material suplementar.

Ethics Statement

Os estudos envolvendo participantes humanos foram revistos e aprovados pelo papel da co-expressão do mRNA HPV E6/E7 e da proteína p16/Ki-67 na previsão do risco de cancro do colo do útero. Por Life Science Ethics Review Committee da Universidade de Zhengzhou. Os pacientes/participantes deram seu consentimento informado por escrito para participar deste estudo.

Author Contributions

S-KZ contribuíram para o desenho e escreveram o manuscrito. ZG contribuiu para a redação e revisão do manuscrito. PW, M-MJ, e P-PG contribuíram para a investigação e teste de DNA de HPV. L-NK e Z-NW contribuíram para o teste de HPV mRNA. D-MZ contribuiu para a citologia e o exame histológico. O QC e X-QC realizaram a análise estatística. X-BS ajudou a conceber o estudo e auxiliou com as análises estatísticas. Y-LQ e J-GZ ajudaram a conceber o estudo e auxiliaram na redação do manuscrito. J-GZ ajudou com a implementação do estudo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Funding

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81502475) e pelo Science and Technology Project da Província de Henan (Grant No. 172102310067).

Conflito de interesses

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Confirmações

Todas as mulheres envolvidas neste estudo são reconhecidas pela sua participação. Agradecemos também a contribuição de todos os médicos relevantes para este estudo e a ajuda do Centro Nacional do Câncer, Hospital do Câncer, Academia Chinesa de Ciências Médicas e Faculdade de Medicina da União de Pequim. Também apreciamos a 32ª Conferência Internacional de Papilomavírus (IPVC 2018) por fornecer uma plataforma para a apresentação do resumo do estudo (título: Desempenho clínico do teste HPV E6/E7 mRNA para detecção de neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau e câncer: Um estudo baseado em hospital na China, IPVC8-0744 Poster Session).

A abreviações

hr-HPV, papilomavírus humano de alto risco; VIA/VILI, inspecção visual com ácido acético/ inspecção visual com solução de Iodo de Lugol; Pap, papanicolaou; SAHZU, Segundo Hospital Filiado da Universidade de Zhengzhou; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Cancer Institute e Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95%CI, intervalos confidenciais de 95%; ECC, curetagem endocervical; TCT, teste citológico ThinPrep; CIN, neoplasia intra-epitelial cervical; LSIL, lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau; HSIL, lesão intra-epitelial escamosa de alto grau; LBC, citologia em meio líquido; PPV, valor preditivo positivo; VNP, valor preditivo negativo; ASC-US, células escamosas atípicas de importância indeterminada; ASC-H, célula escamosa atípica não pode excluir HSIL; AGC, célula glandular atípica; SCC, carcinomas escamosos; AIS, adenocarcinoma in situ.