Fluido Amniótico e Células-Tronco de Membrana Amniótica: Marker Discovery

Abstract

Luído amniótico (AF) e membrana amniótica (AM) foram recentemente caracterizados como fontes promissoras de células estaminais ou progenitoras. Ambas contêm não só subpopulações com características de células estaminais semelhantes às células estaminais adultas, como as células estaminais mesenquimais, mas também apresentam algumas propriedades das células estaminais embrionárias como (i) expressão de marcadores de pluripotência, (ii) alta expansão in vitro, ou (iii) capacidade de diferenciação de várias linhagens. Esforços recentes têm sido concentrados no isolamento e na caracterização detalhada destes tipos de células estaminais. No entanto, variações no seu fenótipo, a sua heterogeneidade descrita por diferentes grupos e a ausência de um único marcador expresso apenas nestas células podem impedir o isolamento de uma população de células estaminais puramente homogénea destas fontes e a sua potencial utilização destas células em aplicações terapêuticas. Neste trabalho, o objetivo é resumir o progresso recente na descoberta de marcadores para células-tronco derivadas de fontes fetais como a FA e AM, utilizando novas metodologias baseadas em transcriptômica, proteômica ou análise do secretoma.

1. Introdução

Both líquido amniótico (FA) e membrana amniótica (AM) representam fontes ricas de células-tronco que podem ser usadas no futuro para aplicações terapêuticas clínicas. As preocupações éticas com o isolamento das células-tronco destas fontes são minimizadas, ao contrário das questões emergentes da pesquisa com células-tronco embrionárias humanas (ESC). A FA é coletada durante amniocentese programada entre a 15ª e 19ª semana de gestação para o diagnóstico pré-natal e o excesso de amostra pode ser utilizado para a obtenção de células, enquanto a AM é geralmente coletada durante as cesarianas de gravidezes de termo. Dada a heterogeneidade das populações de células-tronco derivadas destas fontes, o isolamento de tipos celulares específicos é difícil e requer uma caracterização fenotípica e molecular detalhada das respectivas células. Estudos que incluem abordagens ômicas são fundamentais para melhor compreender os mecanismos de expressão molecular destas células e definir as metodologias corretas para seu isolamento, antes de sua utilização em abordagens terapêuticas.

Este trabalho tem como objetivo apresentar as principais características biológicas e moleculares das células-tronco derivadas de FA e AM e também destacar os recentes avanços na descoberta de marcadores utilizando metodologias globais, como transcriptômica, proteômica ou análises de secretoma.

1.1. Amniotic Fluid

AF serve como um líquido protetor para o embrião em desenvolvimento, fornecendo suporte mecânico e os nutrientes necessários durante a embriogênese. A amniocentese tem sido utilizada há muitas décadas como procedimento de rotina para cariotipagem fetal e diagnóstico pré-natal, permitindo a detecção de uma variedade de doenças genéticas .

O principal componente da FA é a água; contudo a sua composição geral varia ao longo da gravidez. No início da gravidez, a osmolaridade amniótica é semelhante à do plasma fetal. Após a queratinização da pele do feto a osmolaridade amniótica diminui relativamente ao plasma materno ou fetal, principalmente devido ao influxo de urina fetal. Mais interessante, a FA também representa uma rica fonte de uma população de células-tronco derivadas do feto ou da membrana amniótica circundante. Investigações adicionais por vários grupos têm sido recentemente focadas nas propriedades celulares das células derivadas da amniose e seu uso potencial em modelos pré-clínicos e em terapias de transplante .

1.1.1. As células-tronco do fluido amniótico (AFSCs)

As células do fluido amniótico (AFCs) representam uma população heterogênea derivada das três camadas germinativas. Estas células compartilham uma origem epitelial e são derivadas ou do embrião em desenvolvimento ou da superfície interna da membrana amniótica, que são caracterizadas como células-tronco da membrana amniótica . As AFCs são compostas principalmente de três grupos de células aderentes, categorizadas com base em suas características morfológicas, de crescimento e bioquímicas. As células epitelioides (tipo E) são células cubóides a colunares derivadas da pele e urina do feto, as células do líquido amniótico (tipo AF) são originárias das membranas fetais, e as células fibroblásticas (tipo F) são geradas principalmente a partir do tecido conjuntivo fibroso. Tanto as células do tipo AF como as do tipo F partilham uma morfologia fibroblastóide e o tipo celular dominante parece ser o tipo AF, coexpressor de queratinas e vimentinas . Vários estudos têm documentado que células-tronco de fluido amniótico humano (CLAAF) podem ser facilmente obtidas a partir de uma pequena quantidade de FA no segundo trimestre, coletada durante amniocentese de rotina, um procedimento com taxa de aborto espontâneo variando de 0,06 a 0,5% . Até à data, têm sido relatados vários protocolos de cultivo diferentes, levando a populações de células estaminais enriquecidas. O isolamento da AFSC e os respectivos protocolos de cultivo foram resumidos em uma recente revisão por Klemmt et al. e podem ser categorizados da seguinte forma: (i) um protocolo de cultivo em uma única etapa, onde a cultura primária foi deixada intacta por 7 dias ou mais até o aparecimento das primeiras colônias, (ii) um protocolo de cultivo em duas etapas, onde amniócitos, não ligados após 5 dias em cultura, foram coletados e expandidos posteriormente, (iii) seleção do marcador de superfície celular para CD117 (receptor c-kit), (iv) isolamento mecânico das colônias iniciais de células progenitoras mesenquimais formadas nas culturas iniciais, e (v) culturas de curto prazo para isolar as colônias fibroblastoidais. A maioria das AFSCs, isoladas seguindo estas metodologias, compartilharam um fenótipo mesenquimal multipotente e exibiram maior potencial de proliferação e maior potencial de diferenciação em comparação com as MSCs adultas .

1,2. Membrana Amniótica (AM)

A membrana amniótica, sem qualquer tecido vascular, forma a maior parte da camada interna da membrana fetal e é composta de 3 camadas: (i) uma monocamada epitelial constituída por células epiteliais, (ii) uma camada intermediária acelular e (iii) uma camada externa de células mesenquimais, rica em células-tronco mesenquimais e colocada nas proximidades do córion. AM foi usado em clínica durante muitas décadas para a cura de feridas em queimaduras, promovendo a formação de epitélio e protegendo contra infecções . Recentemente, o uso de AM tem sido avaliado como material de curativo para defeitos cirúrgicos da mucosa oral, reconstrução da superfície ocular, perfurações da córnea e aumento da bexiga .

1.2.1. As células-tronco de membrana amniótica (CEMA)

As células-tronco de membrana amniótica (CEMA) incluem dois tipos, as células epiteliais amnióticas (CEA) e as células-tronco mesenquimais de membrana amniótica (CEMA) derivadas das camadas epiteliais amnióticas e mesenquimais amnióticas, respectivamente . Ambos os tipos celulares são originados durante as fases de pré-gastrulação do embrião em desenvolvimento, antes da delineação das três camadas germinativas primárias e são, na sua maioria, de natureza epitelial . Foram estabelecidos vários protocolos para o isolamento de AECs e AM-MSCs, baseados principalmente na separação mecânica do AM da membrana coriônica e a subsequente digestão enzimática . AM-MSCs exibiram aderência plástica e morfologia fibroblastóide, enquanto os AECs exibiram um fenótipo epitelial de calcário. As AM-MSCs compartilharam características fenotípicas semelhantes com as derivadas de fontes adultas. Mais interessante, AM-MSCs, similar às AF-MSCs, exibiram uma maior taxa de proliferação em comparação com as MSCs derivadas de fontes adultas e um potencial de diferenciação de multilineage em células derivadas das três camadas germinativas .

2. Imunofenótipo

2.1. Células-tronco de fluido amniótico

A FA surgiu recentemente como uma fonte fetal alternativa de uma variedade de células de origem de células-tronco . Aqui, o nosso objectivo é resumir os principais marcadores que caracterizam as células estaminais de origem fetal. Até à data, os MSCs representam a subpopulação mais bem caracterizada de AFSCs. Os AF-MSCs apresentam uma expressão típica de marcadores mesenquimais, tais como CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 e CD44, determinados por análises de citometria de fluxo . Além disso, essas células expressaram os antígenos HLA-ABC, enquanto a expressão dos marcadores hematopoiéticos CD34 e CD45, o marcador endotelial CD31 e o antígeno HLA-DR não foi detectada. Mais importante ainda, a maioria dos AF-MSCs cultivados expressou marcadores de pluripotência como a proteína de ligação octamer 3/4 (Oct-3/4), o fator de transcrição homebox Nanog (Nanog) e o antígeno embrionário estágio específico 4 (SSEA-4) .

Também foi relatado que as culturas de amniócitos contêm uma pequena população de CD117 (uma tirosina quinase específica para o fator de células-tronco presente principalmente nas ESCs e células germinativas primordiais) células positivas que podem ser expandidas clonalmente em cultura . As propriedades de diferenciação do CD117+ AFS foram testadas pela primeira vez in vivo, provando desta forma sua identidade de células-tronco . Evidências experimentais sugeriram que as AFSCs são derivadas de células fibroblastóides em forma de fuso .

Numa tentativa de analisar as subpopulações de AFSCs, nosso grupo recentemente identificou duas populações morfologicamente distintas de AFSCs de origem mesenquimatosa, com diferentes propriedades de proliferação e diferenciação, denominadas em forma de fuso (SS) e em forma redonda (RS) . Ambas as subpopulações estavam expressando marcadores de células-tronco mesenquimais em níveis similares. Entretanto, foi identificado que as colônias de SS expressavam níveis mais altos de antígenos CD90 e CD44 em comparação às colônias de RS .

2,2. Células-tronco de membrana amniótica (CEMA)

Uma análise detalhada do imunofenótipo das CEMA revelou a expressão de antígenos, tais como CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , stromal stem cell marker 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, colágeno I e III (Col1/Col3), actina do músculo alfa liso (α-SMA), CD44, vimentina (Vim), proteína da superfície do fibroblasto (FSP) e antígeno HLA-ABC . Entretanto, a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) foi expressa em níveis muito baixos e as proteínas TRA-1-60, proteína de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), fator von Willebrand (vWF), molécula de adesão celular endotelial plaquetária (PECAM-1), CD3, e HLA-DR não foram detectadas. Uma das proteínas mais abundantes encontradas nas células derivadas de AM é a laminina, que desempenha um papel fundamental na diferenciação, forma e migração celular e regeneração dos tecidos. A análise RT-PCR mostrou ainda que as AMSCs expressaram genes, tais como Oct-3/4, proteína do dedo de zinco 42 (zfp42 ou Rex-1), proteína do fator de células-tronco (SCF), molécula de adesão celular neural (NCAM), nestin (NES), proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4), proteína de ligação GATA 4 (GATA-4), e fator nuclear hepatocitário 4α (HNF-4α), mesmo em passagens altas. Brachyury, fator de crescimento fibroblasto 5 (FGF5), proteína de caixa pareada (Pax-6) e proteína morfogenética óssea 2 (BMP2) transcrições não foram detectadas. Da mesma forma, as CEAs foram positivas para CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC e negativas para as expressões CD14, CD34, CD45, CD49d e HLA-DR, conforme determinado pelas análises FACS . Outras investigações mostraram que os AECs estavam expressando marcadores de células-tronco como SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, região determinante do sexo Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 e Tra1-80, fator de crescimento fibroblasto 4 (FGF4), Rex-1, proteína críptica (CFC-1) e prominina 1 (PROM-1) .

3. Transcriptomics

3.1. Células-Tronco de Fluido Amniótico

Uma análise funcional da assinatura da expressão gênica das AF-MSCs comparada à medula óssea (BM-), sangue de cordão (CB-) e AM-MSCs foi inicialmente realizada por Tsai et al. . Genes expressos em CEMs de todas as três fontes puderam ser categorizados em grupos relacionados a (i) remodelação da matriz extracelular (CD44, colágeno II (COL2), fator de crescimento 2 semelhante à insulina (IGF2), e inibidor tecidual da metaloproteinase 1 (TIMP1)), (ii) regulação do citoesqueleto (activador plasminogénio tipo uroquina (PLAU) e receptor (PLAUR)), (iii) regulação e aderência da quimiocina (actinina alfa 1 (ACTN1), subunidade 1B (ARPC1B) e trombospondina 1 (THBS1) do complexo proteico relacionado à actina), (iv) activação de plasmina (inibidor da via do factor tecidual 2 (TFPI2)), (v) fator de crescimento transformador β (TGFβ) sinalização do receptor (caveolina 1 (Cav1), caveolina 2 (Cav2), inibidor de quinase dependente da ciclina 1A (CDKN1A)), e (vi) genes codificadores de E3 ligas ubiquitina (SMURF) . Os genes upregulados nos AF-MSCs comparados aos BM-, CB- e AM-MSCs incluíram moléculas envolvidas na maturação e contração uterina, como o receptor de oxitocina (OXTR) e regulação da síntese de prostaglandina, como a fosfolipase A2 (PLA2G10). Outros genes upregulados neste grupo estiveram envolvidos na transdução de sinal relacionado a (i) resposta desencadeada pela trombina ((F2R e F2RL)), (ii) sinalização de hedgehog ((hedgehog acyltransferase (HHAT)), e (iii) vias relacionadas à proteína G (proteína de ligação GTP (RHOF) relacionada ao rho, regulador de sinalização da proteína G 5 e 7 (RGS5, RGS7), e fosfolipase C beta 4 (PLCB4)).

Em estudos recentes sobre AFSCs, Kim et al. descreveram pela primeira vez a expressão gênica muda na população total de AFSCs durante diferentes passagens através da análise de microarranjos luminosos. 1970 foram detectados genes diferentemente expressos e categorizados de acordo com seus perfis de expressão em 9 clusters distintos . Os genes com níveis de expressão gradualmente crescentes incluíram quimiocina (motivo C-X-C) ligando 12 (CXCL12), caderina 6 (CDH6) e receptor de folato 3 (FOLR3). Os genes desregulados foram, entre outros, ciclina D2 (CCND2), queratina 8 (K8), IGF2, precursor do peptídeo natriurético (BNP) B, e proteína de ligação do ácido retinóico celular 2 (CRABPII). Para obter mais informações, foi realizada análise de dados em chip sobre genes de envelhecimento e revelou-se a upregulação de transcrições de genes, como o fator de crescimento nervoso beta (NGFβ), substrato receptor de insulina 2 (IRS-2), proteína de ligação do fator de crescimento semelhante à insulina 3 (IGFBP-3) e apolipoproteína E (APOE). Expressão de genes, como PLAU, fator de transcrição E2F 1 (E2F1), IGF2, gene de suscetibilidade ao câncer de mama tipo 1 (BRCA1), DNA topoisomerase 2-alfa (TOP2A), antígeno nuclear proliferante de células (PCNA), A forkhead box M1 (FOXM1), o gene da ciclina A2 (CCNA2), que brota desinibida pelo benzimidazoles 1 homolog beta (BUB1B), e a ciclina dependente da quinase 1 (CDC2), foi gradualmente desregulamentada durante a cultura.

Wolfrum et al. realizaram uma análise global da expressão gênica de AFSCs em comparação com iPSCs derivados de AF (AFiPSC) e ESCs . Entre estes, genes relacionados à auto-renovação e pluripotência (1299 genes, por exemplo, POU classe 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, proteína LIN28 de ligação microRNA) e AFSCs específicas (665 genes, por exemplo, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatose tipo 2 (NF2), proteina (CD59), membro da superfamília do fator de necrose tumoral 10 (TNFSF10), 5′-nucleotidase (NT5E)) foram detectados nas AFSCs . Além disso, os autores examinaram a expressão de genes associados à senescência e ao telômero em AFSCs de passagem precoce e posterior, a fim de estudar o efeito da reprogramação sobre o desvio da senescência observada nas culturas de AFSC. Sessenta e quatro genes foram identificados como diferentemente expressos em AFSCs em comparação com as linhas da AFiPSC. Destes, genes associados ao telômero e genes envolvidos na regulação do ciclo celular, tais como a deficiência de parada mitótica tipo 2 (MAD2L2), a polimerase poli ADP-ribose 1 (PARP1), a proteína de replicação A3 (RPA3), a disqueratose congênita 1 (DKC1), o homólogo mutS 6 (MSH6), o homólogo CHK1 (CHEK1), a polo-como a quinase 1 (PLK1), a homeobox 1 POU classe 2 (POU2F1), o CDC2, o gene da síndrome de Bloom RecQ helicoidal (BLM), a síndrome de Werner RecQ helicoidal (WRN), o DNA metiltransferase 1 (DNMT1), o DNA metiltransferase 3 beta (DNMT3B), a lamina B1 (LMNB1) e o fator de replicação de DNA 1 (CDT1), foram desregulamentados nas AFSCs em comparação com as AFiPSCs e ESCs. Em contraste, a peptidilprolil cis/trans isomerase (PIN1), a lamina A/C (LMNA), a parada de crescimento e o dano ao DNA induzível alfa (GADD45A), o homólogo cromobox 6 (CBX6), a NADPH oxidase 4 (NOX4), a endoglina (ENG), histone H2B tipo 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF15), e inibidor de protease serina 1 (SERPINE1), entre outros, foram upregulados nos AFSCs em comparação com os AFiPSCs e ESCs .

3.2. Células-tronco de membrana amniótica

Análise transcritoômica usando microarrays de DNA foi relatada para as CEMAA . Estes dados experimentais forneceram informações sobre o padrão de expressão do gene AM-MSC comparado com os perfis de expressão gênica de AF, CB, e BM-MSCs. Vários genes upregulados em AM-MSCs envolvidos na regulação de adaptação imunológica entre a interface maternoplacentária foram identificados. Entre outros, espondina 2 (SPON2), interferon, proteína alfa induzível 27 (IFI27), receptor de bradicinina B1 (BDKRB1), pequeno membro da subfamília B de citocinas induzíveis 5 e 6 (SCYB5, SCYB6), e homólogo do oncogene relacionado ao sarcoma de Yamaguchi (LYN) foram encontrados upregulados. Além disso, outros genes com expressão aumentada em AM-MSCs em comparação com AF, CB e BM-MSCs incluíram (i) fatores de transcrição, como a caixa de garfo F1 (FOXF1), derivados do coração e crista neural expressos 2 (HAND2) e fator de transcrição 21 (TCF21) e (ii) enzimas metabólicas, como a dipeptidase 6 (DPP6), triptofano 2,3-dioxigenase (TDO2) e sialiltransferases (STs) .

4. Proteómica

4.1. Células-tronco de fluido amniótico

Estudos proteômicos na população total de AFSC, incluindo epitélioides (tipo E), células específicas de fluido amniótico (tipo AF) e células fibroblásticas (tipo F), revelaram 2400 pontos que resultaram na identificação de 432 produtos genéticos diferentes. A maioria das proteínas foi localizada em citoplasma (33%), mitocôndria (16%) e núcleo (15%) e representou principalmente enzimas (174 proteínas) e proteínas estruturais (75 proteínas). Um percentual relativamente alto de membranas e proteínas associadas a membranas também estava presente (7%). Entre as proteínas detectadas, 9 corresponderam a células epiteliais, como a cadeia ATP synthase D (ATP5H), subunidade NADH-ubiquinona oxidoreductase 30 kDa (NUIM), anexina II (Anx2), anexina IV (Anx4), proteína ribossômica 40S SA (Rpsa), glutationa S-transferase P (GSTP), proteína de abóbada maior e citoceratinas 19 e 7 (CK-19, CK-7), enquanto 12 proteínas foram relatadas para serem expressas em fibroblastos, incluindo fibronectinas, tropomiosinas, transgelina (TAGLN), complexo arp2/3 subunidade 34 kDa (P34-arp), gelsolina (Gsn), fator de alongamento 1-β (EF-1β), e outros. Foram encontradas oito proteínas expressas em queratinócitos, incluindo queratinas, ribonucleoproteínas, Anx2, acetil-CoA acetiltransferase (ACAT1), e outras, três a serem expressas em epiderme, incluindo tropomiosinas e queratinas e uma em células mesenquimais (vimentina 1 (Vim 1)).

Estudos recentes forneceram evidências de que uma diversidade de expressão enzimática metabólica nas células amniônicas está envolvida em síndromes metabólicas e genéticas, e assim, sua detecção pode ser importante para o diagnóstico pré-natal. Uma análise mais detalhada para a determinação de enzimas metabólicas específicas presentes nas CLAA foi relatada por Oh et al. . Noventa e nove proteínas foram identificadas, tais como enzimas de manipulação de carboidratos, enzimas de manipulação de aminoácidos, proteínas do metabolismo purínico e enzimas do metabolismo intermediário .

Uma análise proteômica também foi realizada em diferentes passagens de cultura de CD117+ AFSCs, exibindo variações na expressão das proteínas que ocorreram principalmente em passagens precoces . Vinte e três proteínas foram expressas diferentemente entre as passagens precoces e tardias com as proteínas mais aderentes e desreguladas, a Col1, a Col2, a vinculina (Vcl), a CRABP II, a estatmina (STMN1) e a co-filina-1 (CFL1). Em contraste, TAGLN e Col3 são aumentadas durante as passagens. As proteínas que apresentaram níveis desregulados ao longo das passagens foram a subunidade reguladora 26S protease 7 (PSMD7), a isoenzima ubiquitina carboxil terminal hidrolase L1 (UCH-L1), a proteína ribonuclear nuclear heterogênea H (hnRNP H), e a proteína TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) .

Em 2007, o mapa proteômico das AF-MSCs humanas foi construído e comparado diretamente com o derivado das BM-MSCs . 261 diferentes proteínas foram identificadas nas CEMAF com a maioria das proteínas localizadas no citoplasma (41%), enquanto outras foram encontradas no retículo endoplasmático (8%), núcleo (13%), mitocôndria (12%), ribossomos (1%), citoesqueleto (6%), citoplasma e núcleo (5%), e proteínas secretadas (2%) . As AF-MSCs expressaram um número de proteínas relacionadas à proliferação e manutenção celular, como a ubiquilina-1 (UBQLN1), que é conhecida por controlar a progressão do ciclo celular e o crescimento celular, a proteína associada à proliferação 2G4 (PA2G4), uma proteína reguladora do crescimento nucleolar, a proteína ácida secretada e rica em cisteína (SPARC), que é regulada durante a embriogênese e está envolvida no controle do ciclo celular e da adesão celular, e o potenciador de homólogos rudimentares (ERH) que também regula o ciclo celular . TAGLN e galectina 1 (Gal 1), ambas presentes nas células-tronco e relacionadas à diferenciação, também foram abundantemente expressas nas AF-MSCs. Outras proteínas expressas em altos níveis nas AF-MSCs foram relacionadas a (i) desenvolvimento, como Deltex-3-like (DTX3L), e (ii) organização e movimento citoesquelético, como a CFL1, a proteína coactosin-like (CLP), e o homólogo protéico habilitado (Enah). Como esperado, a Vim também foi expressa em altas quantidades nos AF-MSCs. Neste estudo, uma comparação detalhada das proteínas comuns identificadas nas células AF e AF-CMF também foi descrita .

Em nosso estudo posterior, estabelecemos o mapa proteômico dos dois tipos de células progenitoras mesenquimais de FA morfologicamente distintas (SS e RS) por 2-DE. Vinte e cinco proteínas foram expressas de forma diferente nas duas subpopulações. As proteínas upreguladas em SS-AF-MSCs comparadas às RS-AF-MSCs incluíram precursor reticulocalbina-3 (RCN3), colágeno α1 (I) (COL1α1), precursor da proteína 9 de ligação FK506 (FKBP9), inibidor de dissociação Rho GDP 1 (RhoGDI), proteína 4 do canal intracelular do cloreto (CLIC4), triptofanil-tRNA sintetase (TrpRS) e proteína de choque térmico 70 kD (HSP70). Peroxiredoxina 2 (Prdx2), proteína de choque térmico de 60 kD (HSP60), GSTP, e Anx4 foram upregulados em RS-AFMPCs. Entretanto, as proteínas identificadas nos RS-AF-MSCs incluíam apenas citoceratina-8, -18, e -19 (CK-8, -18, e CK-19), catepsina B (CTSB), CLP, e proteína integrina αV (CD51). Proteínas relacionadas ao mesênquima, tais como Vim, Gal, Gsn e proibina (PHB), foram expressas nos mesmos níveis em ambas as populações .

4,2. Células-tronco de membrana amniótica

Uma abordagem detalhada para o estudo das proteínas AM humanas foi descrita por Hopkinson et al. . Neste estudo, os autores realizaram uma análise proteômica de amostras de AM que foram preparadas para transplante humano, utilizando géis 2-DE. Os meios de lavagem das amostras de AM também foram examinados e as proteínas secretadas foram identificadas. As proteínas detectadas tanto no AM quanto no meio de lavagem sugeriram que a liberação parcial de proteínas havia ocorrido. Estas proteínas eram, em sua maioria, proteínas citoplasmáticas solúveis e foram categorizadas de acordo com sua localização e função subcelular. Um exemplo das proteínas mais abundantes e consistentes no AM é o THBS1, que é relatado como desempenhando papel na reparação de feridas, resposta inflamatória e angiogénese. A Mimecan (também denominada osteoglicina/OGN) é outra proteína detectada no AM que representa um pequeno proteoglicano rico em leucina, encontrado no ECM do tecido conjuntivo. O Mimecan é relatado para manter a resistência à tração e hidratação do tecido . Além disso, a forma maior de mimecan foi expressa em células AM e era susceptível à clivagem proteolítica . TGF-β-induced protein ig-h3 (βIG-H3), uma molécula adesiva ECM atuando como fator de crescimento associado à membrana durante a diferenciação celular e cicatrização da ferida, e intergrin α6 (CD49f), um componente da integrina α6β4, também estavam presentes em quantidades significativas nas células AM . É bem conhecido que a interação α6β4-βIG-H3 desempenha um papel importante na mediação da adesão celular e das vias de sinalização da reparação de feridas .

Um outro importante estudo de Baharvand et al. foi focado na análise do AM humano desprovido de epitélio, mostrando diferenças quantitativas e qualitativas em relação ao AM não tratado. Eles investigaram o proteoma do epitélio AM humano, que foi usado como um nicho de células-tronco limbo para tratar a reconstrução da superfície ocular. 515 manchas foram detectadas em todos os géis 2-DE e 43 proteínas foram identificadas usando MALDI TOF/TOF MS em AM. As proteínas mais abundantes foram diferentes isoformas de lumican (LUM) e OGN, ambos membros da família dos proteoglicanos (PG). Em particular, o OGN pode desempenhar um papel em muitos processos biológicos, incluindo o crescimento celular, angiogênese e inflamação. Outras proteínas detectadas incluem colágeno VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), cadeia beta de fibrinogênio (FGB), isoforma A transglutaminase 2 (TGM2A), variante b-actin (ACTB), proteína de choque térmico 5 de 70 kD (HSPA5), nidogênio 2 (NID2), CD49f, βIG-H3, e nefrite tubulointersticial (TIN) . Algumas das proteínas identificadas neste estudo também foram relacionadas à matriz extracelular (ECM). Entre as detectadas, fibronectina (FN), lamininas e colágeno IV (Col4) e VII foram relatadas para promover adesão e migração epitelial .

5. Secretome

Recentemente, progressos significativos foram feitos em relação à análise das proteínas secretadas de AFSCs. Foi documentado que o secretoma de AFSC foi responsável pelo aumento da vasculogênese e foi capaz de evocar uma forte resposta angiogênica em receptores murinos . De acordo com este estudo, uma análise detalhada da mídia condicionada pela AFSC revelou a presença de fatores proangiogênicos e antiangiogênicos conhecidos usando a tecnologia MAP de Luminex. O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o fator 1 (SDF-1) derivado de células estromais, a interleucina 8 (IL-8), a proteína quimiotáxica monocitária 1 (MCP-1) e dois inibidores de angiogênese, interferon-gama (IFNγ) e a proteína 10 (IP-10) induzida por interferon gama, foram identificados como proteínas secretadas. Também foi demonstrado que um número relativamente pequeno de AFSC foi suficiente para secretar uma quantidade detectável de fatores de crescimento proangiogênicos e citocinas. A secreção destas pode ser regulada de forma dose-dependente de acordo com o número de células iniciais das células utilizadas .

Um estudo sistemático sobre as proteínas secretadas por AFSC levou à conclusão de que fatores proangiogênicos solúveis das AFSC podem mediar o recrutamento de progenitores endoteliais em um modelo de rato isquêmico . Em particular, o meio condicionado derivado das CLAAF poderia topicamente fornecer fatores de crescimento angiogênicos e citocinas no retalho cutâneo do modelo isquêmico do rato e foi responsável por desencadear a reparação endógena através do recrutamento de células progenitoras endoteliais .

Em nossos estudos recentes, examinamos o potencial terapêutico de uma CLAAF e suas moléculas secretadas em camundongos com insuficiência hepática aguda . Uma variedade de citocinas e fator de crescimento foram detectados em AF-MSCs condicionadas. Foram detectadas citocinas como a interleucina 10 (IL-10), a interleucina 27 (IL-27), a família das interleucinas 17 (IL-17E), a interleucina 12p70 (IL-12p70), a interleucina-1 beta (IL-1β) e o antagonista dos receptores da interleucina-1 (IL-1ra), responsáveis pela indução da desregulação local e sistêmica dos mediadores pró-inflamatórios. SERPINE1, MCP-1 e SDF-1, responsáveis por promover a reparação tecidual, também foram secretados. Curiosamente, entre os fatores de crescimento altamente expressos estavam o fator de crescimento celular endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), endostatina/colágeno XVII (EN/Col17), ativador do plasminogênio urinário (uPA), TIMP1, TIMP2, fator de crescimento tipo EGF (HB-EGF), fator de crescimento fibroblasto 7 (FGF7) e fator de crescimento epidérmico (EGF), responsável pela regeneração hepática e reparo tecidual .

6. Resumo

Os dados atuais até o momento sugerem que o líquido amniótico e a membrana amniótica podem representar fontes promissoras para células-tronco de origem mesenquimatosa. De facto, os MSCs são mais abundantes e foi descrita uma vasta gama de protocolos para o seu isolamento. No entanto, é relatado que diferentes condições de cultura do mesmo tipo de células podem afetar seu padrão diferencial de expressão gênica, o que representa uma limitação para seu isolamento e expansão in vitro. Estudos incluindo análise fenotípica, utilizando metodologias como citometria de fluxo e imunohistoquímica, bem como abordagens de transcriptômica, proteômica e análise do secretoma, têm como objetivo determinar o perfil proteico dessas células (Figura 1). Espera-se que os dados gerados por tais estudos esclareçam seu repertório diferencial e validem o perfil molecular dessas células-tronco. Entretanto, a principal questão a ser abordada é o isolamento de uma população homogênea que pode facilitar estudos sistemáticos para a elucidação da função destas células multipotentes.

Figura 1

Sumário dos marcadores mais importantes identificados nos AFCs e AMCs pelo uso da transcriptômica, proteômica, secretômica e análises imunofenotípicas. As proteínas identificadas em mais de um estudo são marcadas em negrito.

Estas abordagens podem levar à identificação de antígenos-chave que espelham o fenótipo destas células e explicam as suas propriedades de características distintas. Este tipo de estudos abrirá caminho para um isolamento sistemático e eficiente destas células antes do seu uso no ambiente clínico.

Anexo

Perguntas para Investigação Adicional

Quais são os métodos apropriados de isolamento e condições de cultura de AFSCs ou AMSCs que permitirão a identificação de um fenótipo consistente?

Existe um único marcador que pode ser usado para isolamento de AFSCs ou AMSCs?

As populações de AFSCs e AMSCs são heterogêneas e diferem em suas propriedades fenotípicas e moleculares. Métodos de isolamento podem resultar em uma população celular homogênea.

As AFSCs ou AMSCs podem ser usadas como ferramentas na medicina regenerativa: estabelecimento de condições de cultura com o mínimo ou nenhumas substâncias animais.

Marker Discovery
As AFSCs e as AMSCs podem ser caracterizadas inicialmente através de análise imunofenotípica usando marcadores de superfície celular bem caracterizados como as AFSCs: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSCs: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1, e PROM1.

Transcriptomics and Proteomics Reveled the Identification of Key Markers Expressed such as
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1, e Gal; AMSCs: OGN, βIG-H3, e CD49F.
Desde que não exista um marcador comum disponível para AFSC e AMSC, é necessário utilizar um painel mais amplo de marcadores. Isto também requer a realização de análises mais detalhadas de array e funcionais a fim de definir os marcadores mais apropriados para caracterização de AFSC e AMSC.

Conflito de Interesses

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.