PMC

TEXT

Streptokokit ovat ihmisen suun runsaslukuisimpia asukkaita (6, 24), ja ne pääsevät usein verenkiertoon parodontiittivaurioiden tai rutiinitoimenpiteiden aiheuttamien suun hankaumien kautta (32). Tämä voi johtaa vakaviin sairauksiin, kuten infektiiviseen endokardiittiin (IE) (28) ja neutropeeniseen bakteremiaan (29). Suun streptokokkien taksonomia on pitkään aiheuttanut hämmennystä (4, 9, 20, 22, 31). 16S rRNA -geenin sekvensointi on selventänyt tilannetta huomattavasti (13); tämä lähestymistapa ei kuitenkaan ole riittävän herkkä, jotta voitaisiin erottaa toisistaan tietyt läheisesti sukua olevat lajit, kuten Streptococcus mitis ja Streptococcus oralis (12), tai jotta voitaisiin tehdä kantatyypitys tai fylogeneettinen analyysi lajien sisällä. Tämän vuoksi on tutkittu geenejä, joilla on suurempi vaihtelevuus, kuten 16S-23S rRNA:n intergeenistä transkriptioväliä (ITS) (2), proteiineja koodaavia talousgeenejä (1, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 23) tai molempia (17, 18). Näihin tarkoituksiin parhaiten soveltuvasta geenistä tai geeneistä ei ole vielä päästy yksimielisyyteen. Vaikka aiemmissa tutkimuksissa on tunnistettu suun streptokokkeja kliinisistä veriviljelyistä käyttäen lopullisia sekvensointimenetelmiä (12, 23, 30), yhdessäkään tutkimuksessa ei ole raportoitu yksityiskohtaisia kliinisiä tietoja taustalla olevasta sairaudesta. Tarkoituksenamme oli tehdä molemmat.

Virginian Commonwealth-yliopiston lääketieteellisen keskuksen sairaalassa toukokuusta 2003 toukokuuhun 2008 tehdyt veriviljelyt tunnistettiin kliinisen mikrobiologian laboratoriossa oletettavasti streptokokkeja sisältäviksi. Muiden kuin oraalisten lajien poissulkemiseen käytettiin tietokonekäsikirjoitusta. Kontaminaatioanalyysin välttämiseksi eristyslevyjä pyydettiin vain silloin, kun kaksi tai useampi raportti oli peräisin saman potilaan eri viljelmistä. Yksi pesäke jokaiselta käytettävissä olevalta eristyslevyltä kasvatettiin liemiviljelmässä ja tutkittiin makroskooppisesti ja mikroskooppisesti. Jos samasta potilaasta peräisin olevissa erillisissä viljelmissä havaittiin eroja, molemmat viljelmät säilytettiin. Muussa tapauksessa kustakin potilaasta peräisin oleva yksittäinen viljelmä kryosäilytettiin, ja aliquotit otettiin PCR-monistusta varten.

Kunkin isolaatin laji-identiteetin ja fylogeneettisen sukulaisuuden määrittämiseksi 16S-23S ITS monistettiin käyttäen aiemmin kuvattuja 6R- ja 13BF-alukkeita (2). Kun joistakin isolaateista ei saatu tuotteita, totesimme, että 6R-alukkeen kolme viimeistä nukleotidia eivät kohdanneet useiden kiinnostavien lajien 23S rRNA-sekvenssejä GenBankissa. Tämän vuoksi lyhensimme ja yksinkertaistimme 6R-alkuria, jolloin syntyi 6R-S, ja lyhensimme 13BF-alkuria vastaamaan sen annealing-lämpötilaa (ks. lisämateriaalin taulukko S1). Samanlainen 6R-alukkeen muutos raportoitiin hiljattain (18). Näiden alukkeiden avulla PCR-amplikonit saatiin kaikista isolaateista ja toimitettiin kapillaariseen DNA-sekvenssianalyysiin.

Useimmat DNA-sekvenssit sisälsivät täydellisen ITS:n ja osia 16S- ja 23S-rRNA-geeneistä, jotka sovitettiin yhteen GenBankissa saatavilla olevien tyyppikantojen ITS-sekvenssien kanssa tai jotka määrittelimme itse American Type Culture Collection (ATCC) -kokoelmasta (Amerikan tyyppiviljelykokoelmasta (ATCC) saaduista kannoista. Havaitsimme, että 16S- ja 23S-sekvenssejä reunustavat sekvenssit, vaikka niitä ei useimmissa julkaistuissa sekvensseissä säilytettykään, helpottivat ITS-sekvenssien kohdistamista. Ainakin neljä tyyppikannan sekvenssiä on julkaistu (18), joissa CTAAGG-sekvenssi, joka sijaitsee 78 bp ennen 16S rRNA -geenin 3′-päätä, on ilmeisesti sekoitettu identtiseen heksanukleotidisekvenssiin, joka on määritelty aiemmin (2) ITS:n alkupisteeksi. Trimmattuja ITS-sekvenssejä (2) verrattiin ja linjattiin MEGA 4 -ohjelmistolla (25), jotta saatiin muodostettua naapuriliitos-fylogeneettinen puu (kuva 1).

Aiemmin on esitetty, että pelkkä ITS-analyysi riittää suun streptokokkien lajinmääritykseen, mukaan lukien läheisesti sukua olevien lajien S. mitis ja S. oralis. Konservoituneiden yhden emäksen deleetioiden kahdessa kohdassa ja ITS:n kokonaispituuden 246 bp on ehdotettu olevan tyypillisiä S. oralis -lajille, kun taas S. mitis -lajille on ehdotettu, että deleetioita ei ole ja että ITS:n pituus on 248-249 bp (2, 3). Tutkimuksessamme löysimme molempien lajien isolaatteja, joilla oli molempia poistoja tai ei kumpaakaan, sekä päällekkäisiä ITS-pituuksia. Näin ollen S. oralis- ja S. mitis -isolaatteja ei voitu luotettavasti erottaa toisistaan näiden kriteerien perusteella. Eräässä toisessa tutkimuksessa on esitetty, että vaikka ITS-sekvenssianalyysi ei riitä S. oralis- ja S. mitis -lajien erottamiseen toisistaan, se riittää monien muiden suun streptokokkilajien, myös anginosusryhmään kuuluvien lajien, tunnistamiseen (18). Löysimme kuitenkin yhden anginosus-ryhmään kuuluvan S. intermedius -lajin isolaatin (VMC38), jota ei voitu luokitella ITS:n avulla (ks. taulukko S1 lisämateriaalissa).

Lukuisten isolaattien, erityisesti S. mitis ja Streptococcus constellatus, sekvenssit olivat myös identtisiä, mikä esti fylogeneettisen analyysin. Identtiset sekvenssit saatiin myös viidestä samoista potilaista peräisin olevasta isolaattiparista (tietoja ei ole esitetty).

Koska ITS-analyysi ei riittänyt tarkoituksiimme, sekvensoimme toisen yhteisen kohteen – sodA-geenin, joka koodaa mangaanista riippuvaista superoksididismutaasia (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Tämä mahdollisti useiden isolaattien poissulkemisen. Edellä mainituilla kantapareilla, jotka olivat peräisin samoista koehenkilöistä ja joilla oli identtiset ITS-sekvenssit, oli myös identtiset sodA-sekvenssit, mikä vahvisti, että isolaatit olivat identtisiä, ja yksi isolaatti kustakin parista jätettiin pois. Kaksi isolaattia hylättiin, koska kantojen käsittelyssä oli ilmeisesti tapahtunut virhe, ja toista isolaattia ei hyväksytty, koska ITS- ja sodA-sekvenssit osoittivat, että se oli Enterococcus faecalis -kanta. Jäljelle jääneistä isolaateista johdettu fylogeneettinen puu on esitetty kuvassa 1.

SodA-kohdistus oli fylogeneettisessä analyysissä parempi kuin ITS-kohdistus. Ainoat isolaatit, joilla oli identtiset sodA-sekvenssit, olivat kaksi S. mitis -kantaa ja kaksi Streptococcus vestibularis -kantaa. SodA-kohdistus oli hyödyllisempi myös lajinmäärityksessä. Kaikki vertailukannat erottuivat hyvin toisistaan fylogeneettisessä puussa. Tuloksena oli vain neljä epäselvää lajimääritystä sodA:n osalta, kun taas ITS:n osalta niitä oli 15 (ks. lisäaineiston taulukko S1). Niissä tapauksissa, joissa yksi lajinimitys oli yhdenmukainen sekä ITS- että sodA-sekvenssien kanssa, käytettiin tätä nimitystä. Lopullisista 58 kliinisestä isolaatista vain kolmea ei voitu varmuudella tunnistaa tällä menetelmällä. VMC1- ja VMC43-isolaatit tuottivat ITS-sekvenssejä, jotka olivat liian lyhyitä ollakseen informatiivisia toistuvista sekvensointiyrityksistä huolimatta, ja VMC58:n tunnistaminen ITS- ja sodA-sekvenssien perusteella oli epäjohdonmukaista (kuva 1; taulukko S1). Vahvistimme näiden isolaattien laji-identiteetin käyttämällä hiljattain julkaistua tietokantaa, joka sisältää 420 hyvin karakterisoidun streptokokkikannan seitsemän talousgeenin, kuten sodA:n, pfl:n ja pyk:n, sekvenssejä (1). Kaikkien kyseenalaisten kantojen pfl- ja/tai pyk-geenien sekvenssit määritettiin ja linjattiin eMLSA.net-tietokannassa (http://www.emlsa.net/) olevien sekvenssien kanssa, samoin kuin olemassa olevat sodA-sekvenssit. Kaikissa tapauksissa pfl- ja pyk-geenien lajimääritykset olivat sopusoinnussa sodA:sta saatujen määritysten kanssa. Lisäksi sodA-kohdistus osoitti, että vaikka VMC58-sekvenssi poikkesi tyyppikannasta, se kuului tietokannassa olevaan 13 Streptococcus infantis -isolaatin klusteriin (tietoja ei ole esitetty). Kaikkien tutkimuksessa mukana olleiden isolaattien konsensuslajitunnukset on esitetty kuvassa 1 ja lisäaineiston taulukoissa S1 ja S2.

Vaikka nämä tulokset viittaavat siihen, että pelkkä sodA-analyysi riittää useimpien kantojen tunnistamiseen, suosittelemme vähintään yhden ylimääräisen proteiineja koodaavan housekeeping-geenin sisällyttämistä kaikkiin kantoihin. Monet suun streptokokit ovat luonnostaan kyvykkäitä, ja on raportoitu tapauksia, joissa on hankittu vieraita housekeeping-geenejä, mukaan lukien sodA, (1, 12). Tämä ei näkynyt tutkimuksessamme, mutta kimeerisiä ITS- (VMC38 ja VMC50) ja sodA- (VMC33) sekvenssejä esiintyi. Kahdessa viimeaikaisessa julkaisussa on menty pidemmälle, ja kummassakin on ehdotettu eri seitsemän housekeeping-geenin sekvensointia monen fokuksen sekvenssityypitystä (7) tai monen fokuksen sekvenssianalyysiä varten (1). Nämä lähestymistavat perustuvat suuremman geenimäärän analysointiin, jotta saadaan parempi resoluutio ja minimoidaan satunnaisten kimeerien tai vieraiden geenien vaikutukset (1, 7). Nämä järjestelmät mahdollistavat myös hienostuneemmat fylogeneettiset analyysit kuin mitä on mahdollista tehdä vain kahdella tai kolmella geenillä. Meillä oli kuitenkin toisinaan vaikeuksia pfl:n ja pyk:n monistamisessa ja sekvensoinnissa, ja kahden muun suositellun geenin, mapin ja ppaC:n, monistaminen ja sekvensointi onnistui huonosti (1). Eräässä toisessa hiljattain tehdyssä tutkimuksessa raportoitiin samankaltaisista vaikeuksista (27). Näin ollen lisägeenien valinta voi vaatia empiiristä testausta, mutta seitsemän geenin analyyseissä käytettyjä geenejä olisi tutkittava ensin, koska vertailua varten on saatavilla laajoja sekvenssikokoelmia hyvin karakterisoiduista kannoista (1, 7).

Tietojemme mukaan tämä on vasta toinen raportti Streptococcus australis (12) tai S. infantis (30) -veriviljelyisolaatista. Ainoa muu yhteys jälkimmäisen lajin ja jonkin sairauden välillä on kahdesta raportista, joissa se on eristetty kystistä fibroosia sairastavien aikuisten ysköksestä (17, 26). Siksi on mielenkiintoista, että S. infantis -isolaattimme VMC58 oli peräisin kystistä fibroosia sairastavalta aikuiselta (ks. lisäaineiston taulukko S2).

Taulukkoon S2 on koottu antibioottiherkkyystietoja, ja ne ovat suurelta osin yhdenmukaisia aiempien tutkimusten kanssa (8). Taulukossa S2 esitetään myös lähdepotilaiden kliiniset ja demografiset tiedot, jotka on luokiteltu pääasiallisen perussairauden perusteella: lääketieteellinen sairaus, pahanlaatuinen sairaus, IE tai leikkaus/trauma. Kaikki IE-henkilöt diagnosoitiin kliinisesti, ja kaikki muut paitsi VMC56-tapaus (taulukko S2) luokiteltiin ”varmaksi IE:ksi” modifioitujen Duke-kriteerien mukaisesti (16). Ainoa poikkeus oli aiempi IE ja suonensisäinen huumeiden käyttö, mikä yhdessä positiivisten veriviljelyjen kanssa johti luokitteluun ”mahdolliseksi IE:ksi”. Lisäksi tutkittiin tietoja mahdollisista infektiolähteistä, kuten keskuslaskimokatetrista, ruoansulatuskanavan endoskopiasta, suun limakalvotulehduksesta, hammaslääketieteellisistä olosuhteista ja IVDU:sta. IVDU todettiin 9:llä 13:sta IE-potilaasta ja vain yhdellä muulla tutkimukseen osallistuneella potilaalla (taulukko S2). Tämä ero oli tilastollisesti merkitsevä (P < 0,0001; Fisherin tarkka testi). Näin ollen, vaikka tässä tutkimuksessa keskityttiin oraalisiin lajeihin, IVDU oli ylivoimainen riskitekijä.

Fylogeneettinen analyysimme ei paljastanut tilastollisesti merkitseviä yhteyksiä minkään tietyn lajin tai kloonityypin ja perussairauden tai muiden kliinisten parametrien, kuten valkosolujen lukumäärän, korkeimman lämpötilan, kasvuston koon, vaurioituneen läpän tai potilaan kuoleman välillä. Yksi aiempi tutkimus sisälsi riittävästi tietoa neutropeenisista potilaista eristettyjen lajien tunnistamiseksi (12). Tuloksemme olivat samankaltaisia, sillä kyseisessä tutkimuksessa 12:sta isolaatista 11 ja omassa tutkimuksessamme 10:stä 9 (taulukko S2) oli joko S. mitis tai läheisesti sukua oleva S. oralis. Tutkimuksessamme nämä kaksi lajia yhdessä eristettiin neutropeenipotilaista huomattavasti todennäköisemmin kuin 12 muuta lajia yhteensä (P = 0,004; Fisherin tarkka testi). Tämä saattaa heijastaa näiden lajien yleisyyttä suuontelossa. On kuitenkin mielenkiintoista, että tämä suuntaus ei siirtynyt IE:hen. Kun yhdistetään tietomme saman tutkimuksen (12) neutropeniaa ja IE:tä koskeviin tietoihin, S. oralis ja S. mitis eristettiin 20:stä 22:sta neutropeniatapauksesta ja vain 15:stä 27:stä IE-tapauksesta, mikä ero oli tilastollisesti merkitsevä (P = 0,01; Fisherin tarkka testi). Kuten aiemmissa tutkimuksissa (11, 12, 30), näytemäärät rajoittivat kykyämme arvioida luotettavasti muita mahdollisia yhteyksiä lajien ja tiettyjen sairauksien tai kliinisten ominaisuuksien välillä. Yhdistämällä lopullisen lajitunnistuksen kunkin lähdepotilaan kliinisiin ja demografisiin ominaisuuksiin (taulukko S2) olemme kuitenkin pyrkineet tekemään tuloksistamme soveltuvia meta-analyyseihin tai muihin tutkimuksiin, joissa hyödynnetään yhdistettyjä tietoja.

.